本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种高载铁量的蛋白琥珀酸铁的制备方法。
背景技术：
铁元素是构成人体的必不可少的元素之一，缺铁会影响到人体的健康和发育，最大的影响即是缺铁性贫血。世界卫生组织的调查表明，大约有50％的女童、20％的成年女性、40％的孕妇会发生缺铁性贫血。补铁是通过食物或药物方法为人体额外补充必须的、适量的无机铁或有机铁化合物，从而补充铁元素以达到强身健体、预防或辅助治疗疾病目的的过程。
蛋白琥珀酸铁是一种有机铁化合物，它在酸碱度ph值小于4时呈沉淀物，而在酸碱度ph较高时(ph值为7.5-8时)又可变为可溶性物质，此外，该制剂不能被胃蛋白酶消化，却在中性ph值时可被胰蛋白酶水解。由于上述这些性质，蛋白琥珀酸铁能被蛋白膜保护而不与胃液中的盐酸及胃蛋白酶发生反应，从而避免胃粘膜损伤，适应症为用于由于铁的摄入量不足或吸收障碍、急性或慢性失血以及感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血，妊娠及哺乳期贫血等绝对和相对缺铁性贫血。
采用传统的蛋白琥珀酸铁的制备方法制备出的产品的载铁量仅为5％左右，其主要原因为蛋白质为一种高分子化合物，铁和琥珀酸以络合的方式存在，传统的方法在蛋白质上接琥珀酸时，并未把蛋白质充分打开，由于空间位阻效应，导致琥珀酸接枝率低，同时由于空间位阻效应，导致三价铁和蛋白质上的琥珀酸络合率低，从而导致采用传统方法制备出来的琥珀酸蛋白铁的载铁量低，进而导致给药剂量高，且不利于开发成给药及贮存方便的传统固体制剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高载铁量的蛋白琥珀酸铁的制备方法，其在蛋白质上接琥珀酸及在琥珀酰蛋白与铁络合反应过程中，加入蛋白质结构展开剂，使得琥珀酸接枝率提高，三价铁的络合率提高，从而提高蛋白琥珀酸铁的载铁量(达到15％左右)，然后恢复蛋白质空间结构，使得铁离子包裹在蛋白质中，形成屏障，减小铁对胃肠道的刺激，增加铁的生物利用度，减小给药剂量，减少蛋白质规格，从而可以使本品赋予常规的固体剂型。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高载铁量的蛋白琥珀酸铁的制备方法，包括如下步骤：
(1)酰化：向酪蛋白溶液中加入蛋白质结构展开剂搅拌使其溶解，随后加入琥珀酸酐反应，并不断加入氢氧化钠溶液保持反应液ph值在6以上，反应完后，加酸调节反应液ph值为2-3，使酰化蛋白析出，经过滤得沉淀，即为琥珀酰蛋白；
(2)载铁：向步骤(1)中得到的琥珀酰蛋白中缓慢加入氢氧化钠溶液，搅拌使其溶解，溶解完后溶液ph值为7-9，加入蛋白质结构展开剂搅拌使其溶解，并升温至40-60℃，随后缓慢滴加三氯化铁溶液，同时滴加氢氧化钠溶液维持反应液ph值在6-9，三氯化铁溶液滴加完毕后，继续搅拌反应3小时，反应结束后，降温至5-15℃，加酸调节反应液ph值为2-3，使蛋白琥珀酸铁析出，经过滤，水洗后得到蛋白琥珀酸铁粗品；
(3)精制：将步骤(2)中得到的蛋白琥珀酸铁粗品加入氢氧化钠溶液中搅拌使其溶解，溶解完后溶液ph值为7-9，升温至40-60℃，随后缓慢滴加盐酸溶液调节ph值为2-3，并缓慢降温至5-15℃，继续搅拌使得蛋白琥珀酸铁充分析出，经过滤，水洗后干燥得到蛋白琥珀酸铁成品。
进一步地，步骤(1)中，向酪蛋白中缓慢加入氢氧化钠溶，搅拌溶解，溶解完后溶液ph值为7-9，加入蛋白质结构展开剂搅拌使其溶解，并升温至40-60℃，优选为50℃，随后加入琥珀酸酐反应，通过不断加入氢氧化钠溶液保持反应液ph值在6以上，反应完后，降温至5-15℃，优选为10℃，缓慢滴加适量盐酸溶液调节反应液ph值至2-3，过滤得沉淀。
进一步地，所述蛋白质结构展开剂为2-巯基乙醇、2-硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸中一种或几种。
进一步地，所述蛋白质结构展开剂的加入量为0.1-5％。
进一步地，所述步骤(1)中加入酪蛋白与琥珀酸酐的质量比为(10-15):1。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)水洗过程中，纯水的温度为0-10℃，优选为5℃。
进一步地，最终制备得到的蛋白琥珀酸铁成品的载铁量为14％-18％。
本发明具有如下有益效果：
本发明在蛋白质上接琥珀酸及琥珀酰蛋白与铁络合反应过程中，加入蛋白质结构展开剂，使得琥珀酸接枝率提高，三价铁的络合率提高，从而提高蛋白琥珀酸铁的载铁量(经过测试载铁量为14％-18％)，然后恢复蛋白质空间结构，使得铁离子包裹在蛋白质中，形成屏障，减小铁对胃肠道的刺激，增加铁的生物利用度，减小给药剂量，减小蛋白质规格，从而可以使本品赋予常规的固体剂型。此外，通过控制酰化反应的温度在40-60℃，酰化析晶的温度在5-15℃；铁络合反应过程中温度为40-60℃，络合析晶的温度为5-15℃；蛋白琥珀酸铁精制过程中温度为40-60℃，析晶的温度为5-15℃，水洗用纯化水温度0-10℃，显著提高制备出产品的收率，减少产品的损失，且产品质量均一稳定。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进一步进行说明。
实施例1
本实施例提供一种高载铁量的蛋白琥珀酸铁的制备方法，包括如下步骤：
(1)酪蛋白的酰化
称取酪蛋白1kg，缓慢加入ph为9的氢氧化钠溶液(5l)中，一边加入一边搅拌，使之溶解；加入蛋白质结构展开剂(2-巯基乙醇、2-硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸中一种或几种)，本实施例中蛋白质结构展开剂为2-巯基乙醇5g，然后将温度升至50℃，缓慢滴加琥珀酸酐80g，边滴加边监测ph，不断加入氢氧化钠溶液保持反应液ph值在6-9之间，滴加完毕后在50℃下搅拌2h，使之充分反应。
反应完成后，将温度降至10℃，然后缓慢滴加0.1m的盐酸，调节体系ph为2-3，使得琥珀酰蛋白缓慢析出，滴加完毕，继续搅拌1h，使得琥珀酰蛋白充分析出后经过滤，用10℃的ph3-4的盐酸溶液洗涤3次，滤饼用ph3-4的盐酸溶液2l，在10℃下打浆，之后再过滤，滤饼用5℃的纯化水洗涤3次，然后40℃，真空干燥48h，即得蛋白琥珀酸936g。
(2)载铁反应(蛋白琥珀酸铁粗品制备)
取蛋白琥珀酸500g，缓慢加入ph为9的氢氧化钠溶液(2.5l)中，边加入，边搅拌，使之溶解；之后加入2-巯基乙醇2.5g，然后将温度升至50℃，缓慢加入20％的三氯化铁溶750g，同时滴加0.1m的氢氧化钠溶液维持反应液ph值在6-9。三氯化铁溶液滴加完毕，继续搅拌反应3小时，使三价铁与琥珀酸充分络合。
反应结束后，将体系温度降至10℃，然后缓慢滴加0.1m的盐酸，调节体系ph2-3，使得蛋白琥珀酸铁缓慢析出，滴加完毕，继续搅拌1h，使得蛋白琥珀酸铁充分析出。
经过滤后，用10℃的ph3-4的盐酸溶液洗涤3次，滤饼用ph值为3-4的盐酸溶液2l，在10℃下打浆，之后再经过滤，滤饼用5℃的纯化水洗涤3次，得蛋白琥珀酸铁湿品。
(3)蛋白琥珀酸铁精制
将蛋白琥珀酸铁湿品溶于ph7-9的氢氧化钠溶液(1.5l)中，升温至50℃，然后缓慢降温至10℃，用0.1m的盐酸将体系酸碱度调节至ph3-4，使得蛋白琥珀酸铁充分析出，继续搅拌3小时，之后过滤，率饼分别用5℃，ph3-4的盐酸洗涤一次，然后再用5℃的纯化水洗涤2次。抽干滤液，再进行真空干燥，40℃条件下干燥48小时，得到蛋白琥珀酸铁成品463g。
实施例2
蛋白琥珀酸铁载铁量的测定
精密称取实施例中制备得到的蛋白琥珀酸铁0.5g，置25ml坩埚中，按照中国药典2015版第四部通则要求，600℃炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸2ml使炭化物全部湿润，100℃加热至硫酸蒸气除尽。然后在600℃下炽灼5小时，使供试品完全灰化，放冷，加盐酸6ml微热使溶解，移置250ml碘瓶中，坩埚用水40ml分数次洗涤，洗液合并，加碘化钾0.4g，密闭，摇匀，放置在暗处10分钟，然后加水20ml，待滴定用。
用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/l)滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失。并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/l)相当于5.585mg的铁(fe3+)。
平行测定样品3份，取平均值，滴定结果如表1所示：
表1
实施例3
游离铁含量测定
对照品溶液制备
精密称取硫酸铁铵(十二水合)，117.8mg，置50ml量瓶中，加5％硫酸溶液10ml溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含铁12.5μg)。
供试品溶液制备
精密称取取蛋白琥珀酸铁原料1g，置于25ml量瓶中，加入ph9的氢氧化钠溶液，使之溶解，定容。之后加入丙酮50ml，是蛋白琥珀酸铁沉淀，4000rpm离心，取上清液，用0.45μm的pes膜过滤，滤液即为蛋白琥珀酸铁供试品溶液。
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液4ml，置25ml量瓶中，加入硫氰酸钾溶液(取硫氰酸钾15g，置100ml量瓶中，加水约50ml溶解后，加丙酮15ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得)15ml，用水稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版第四部)，立即在471nm的波长处测定吸光度，通过吸光度计算游离铁含量，含游离铁不得超过0.2％。
测定结果见表2。
表2
实施例4
2-巯基乙醇残留量测定
供试品溶液配制
精密称取取蛋白琥珀酸铁原料1.0g，将其溶于5ml的ph9的氢氧化钠的dmso(60％)的溶液中，平行配制3份，为供试品溶液。
对照品溶液制备
精密称取2-巯基乙醇95mg，置于已经含有少量的ph值为9的氢氧化钠的dmso(60％)的100ml量瓶中，然后用ph值为9的氢氧化钠的dmso(60％)稀释至刻度，摇匀，作为对照母液。
精密量取对照母液1ml，于100ml容量瓶中，加ph值为9的氢氧化钠的dmso(60％)稀释至刻度，定容摇匀，精密量取5ml的该稀释液，置于20ml的顶空瓶中，作为对照品溶液。
分析方法为气相，仪器为岛津气相色谱仪，gc2010pro。
气相色谱条件如表3。
表3
对照品连续进样6针，rsd＜10％，对照品与杂峰之间的分离度符合要求，供试品峰面积小于对照品峰面积(0.03％)。
测定结果：对照品峰面积平均12304.45，供试品峰面积为2346.23，远远小于对照品峰面积，符合要求。
本发明在蛋白上接琥珀酸及琥珀酰蛋白与铁络合反应过程中，加入蛋白质结构展开剂，使得琥珀酸接枝率提高，三价铁的络合率提高，从而提高蛋白琥珀酸铁的载铁量(经过测试载铁量为14％-18％)，然后恢复蛋白空间结构，使得铁离子包裹在蛋白中，形成屏障，减小铁对胃肠道的刺激，增加铁的生物利用度，减小给药剂量，减小蛋白规格，从而可以使本品赋予常规的固体剂型。此外，通过控制酰化反应的温度在40-60℃，酰化析晶的温度在5-15℃；铁络合反应过程中温度为40-60℃，络合析晶的温度为5-15℃；蛋白琥珀酸铁精制过程中温度为40-60℃，析晶的温度为5-15℃，水洗用纯化水温度0-10℃，显著提高制备出产品的收率，减少产品的损失，且产品质量均一稳定。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。