本发明涉及分析检测领域，特别涉及痕量、超痕量组分的基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法。
背景技术：
分析检测过程中，样品前处理技术过程操作复杂、繁琐，成本高昂，处理过程需要消耗大量人工，需要消耗大量对人体或环境有毒有害溶剂萃取样品，因此前处理技术发展滞后是制约现代分析技术的重要因素，近年来分析工作者发明了如液—液微萃取、自动索氏提取、吹扫捕集、微波辅助萃取、超临界流体萃取，超声波萃取，固相萃取、固相微萃取、顶空法、膜萃取、加速溶剂萃取等，但是这些方法需要购置昂贵的仪器，而且部分方法虽然实现了自动化但分离萃取原理不变因此效率仍旧不高。随着社会经济发展，人们寿命增长和生活质量提高，人们对于环境质量、食品安全、医疗检测的要求也越来越高，对痕量样品分析高效，准确地检测的需求也应运而生。传统的检测的方法主要有气相色谱法(gc)，气相色谱与质谱联用法(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)等。这些方法分离效率高，检测性能好，分析时间相对较短，但是不能直接给出定性结果，需要与已知标准品对照确定，操作复杂，设备昂贵。化学试剂显色法虽然反应时间快，操作简单，可应用于现场检测，但是其灵敏度不高。目前使用核酸适配体的生物传感技术连接核酸适配体的位置空间位阻大，探针不易连接导致其灵敏度不高，不能作为标准检测方法。
目前现有的技术的缺陷是：样品前处理过程操作繁琐、成本高。分析检测过程成本高、特异性差、检测灵敏度不够高难以满足痕量样品检测的需求，难以做到标准检测。
而本发明提供了一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法。具有无需样品前处理、快速分离并高特异性检测复杂体系中目标物、检测信号自适应放大、可完成高灵敏一体化标准检测等优点。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，利用该方法可以进行复杂样品的高灵敏度痕量、超痕量检测。
本发明基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，包括如下步骤：
1)通过磁珠介导在磁珠表面修饰核酸适配体；所述核酸适配体用于特异性结合目标物；
2)将修饰好的磁珠-核酸适配体溶液与被测样品混合孵育，并进行提取磁分离；
3)孵育后利用新型定位探针进行介导剪切，加入限制性核酸内切酶，将未与样品结合的核酸适配体的目标片段剪切下来并进行检测磁分离；所述的新型定位探针为非对称发卡状dna；没有3’端的侧臂，且3’端的茎上缺少一个或两个碱基；茎上含有限制性核酸内切酶的不完整识别位点；当核酸适配体与目标物结合时呈核壳结构，所述新型定位探针无法与核酸适配体结合；未与目标物结合的核酸适配体呈初始线形结构，在特定位置将暴露碱基；所述不完整识别位点即可与核酸适配体利用碱基互补配对形成完整的识别序列；在限制性核酸内切酶的作用下快速剪切核酸适配体，获得所需的目标片段；
4)将被剪切下的目标片段进行体外扩增，根据实时荧光的信号出峰时间进行浓度检测，剪切得到的目标片段浓度越大，出峰时间越短。
作为本发明的一种优选方案，所述的核酸适配体是一段基于目标物体外筛选获得的寡核苷酸序列或者多肽。
作为本发明的一种优选方案，所述的核酸适配体用生物素修饰，磁珠由链霉亲和素修饰；通过链霉亲和素和生物素的特异性结合把核酸适配体接到磁珠表面，得到磁珠-适配体溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述的混合孵育过程包括：将修饰好的磁珠-核酸适配体溶液与磷酸缓冲盐溶液、被测样品混合，室温静置至多30min，使被测样品中的目标物与磁珠上的核酸适配体特异性结合。
作为本发明的一种优选方案，所述的介导剪切过程需要在50～55℃的恒温条件下进行。
作为本发明的一种优选方案，所述的提取磁分离过程包括：利用引入的磁场进行磁珠提取，带有适配体的磁珠将目标物从复杂样品中分离。
作为本发明的一种优选方案，所述的检测磁分离过程包括：利用引入的磁场进行磁珠提取，将磁珠与目标片段进行分离
作为本发明的一种优选方案，所述体外扩增包括pcr扩增或等温扩增。
与现有技术相比本发明，本发明提供的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，利用核酸适配体特异性好，与样品结合位置空间位阻小的优势，结合介导剪切选择性定位探针，实现对目标序列的可编程的任意位点剪切。与核酸等温扩增结合明显增强检测信号。本发明对于复杂样品不需要繁琐的样品前处理过程，定位剪切可控性高，操作简单，可以实现高通量标准化的检出模式。本发明的高特异性的，高灵敏度的可以应用于各种痕量、超痕量样品组分检测。从理论上该方法可实现高灵敏的甚至单分子检测。甲基苯丙胺毒品检测证明了该方法的有效性。
附图说明
图1显示了针对特异性识别甲基苯丙胺的核酸适配体的新型非对称发卡状dna选择性定位探针的结构；
图2显示了使用本发明的检测方法与装置对不同浓度的甲基苯丙胺标准溶液进行检测的实时荧光曲线图；
图3显示了使用本发明的检测方法与装置对血清样本中不同浓度的甲基苯丙胺进行检测的实时荧光曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明，但本发明并不仅限于以下实施例。
本发明提供的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其中所用原料与试剂均可由市场购得。
实施例1
以检测痕量毒品甲基苯丙胺为例，本发明首先通过磁珠介导在磁珠表面修饰核酸适配体(核酸适配体的碱基序列如seq.idno1所示，具体为：acggttgcaagtgggactctggtaggctgggtaatttgg，本实验所述适配体为甲基苯丙胺适配体)，用生物素修饰核酸适配体，取10μl10-5m的适配体溶液加入90μl的水中得到10-6m的适配体溶液100μl，待用。取10μl浓度为10-6m的适配体溶液，25μl直径为1μm的链霉亲和素修饰的磁珠溶液，5μl20×pbs溶液，以及60μl的水，混合均匀，在室温下孵育30分钟，通过链霉亲和素和生物素的特异性结合把特异性识别甲基苯丙胺的核酸适配体接到磁珠表面，将得到的磁珠-适配体溶液用1×pbs清洗3遍，再用100μl1×pbs溶液溶解，得到磁珠-适配体溶液。
将与适配体互补的选择性定位探针spp和限制性内切酶rease混合并孵育30分钟，得到spp-rease混合溶液。在冰上分别配置expar反应的预混合液a和b，预混合液a中包含dntps，nebuffer3.1和expar扩增模板，预混合液b中含有sybrgreeni，bst2.0warmstartdnapolymerase，切口内切酶nt.bstnbi和水，a与b混合配置等温扩增溶液。配置浓度为10-9m至10-13m的甲基苯丙胺标准溶液溶五组(浓度分别为10-9m、10-10m、10-11m、10-12m、10-13m)。
取25μl上述磁珠-适配体溶液，加入甲基苯丙胺溶液在室温下孵育30分钟。
孵育后的溶液由微流控芯片的样品进样口引入，同时取10.5μl的spp-rease混合溶液由反应溶液进样口1引入，流控模块操控驱动泵阀控制两路液体的流速，使二者在混合区均匀混合5分钟。升温至55度，使spp与适配体结合，剪切酶绑定到spp上，发生特异性剪切。混合后的溶液流入磁分离区，磁控模块控制其内部电磁线圈产生磁场，吸附磁珠留在磁分离区。不含磁珠的混合溶液带着目标核酸片段进入等温扩增区，此时从反应溶液进样口2引入200μl的等温扩增溶液，使二者在等温扩增区混合进行等温扩增反应60分钟，并以30秒的间隔监测等温扩增区的实时荧光。整个过程中温控模块保持混合区、磁分离区、等温扩增区为55℃恒温，温控精度为±1℃。
如图1所示，本发明的新型定位探针为非对称发卡状dna；没有3’端的侧臂，且3’端的茎上缺少一个c碱基；茎上含有限制性核酸内切酶的不完整识别位点。当核酸适配体与目标物结合时呈团状结构，所述新型定位探针无法与核酸适配体结合；未与目标物结合的核酸适配体呈线形结构，在特定位置将暴露c碱基；所述不完整识别位点即可与核酸适配体利用碱基互补配对形成完整的识别序列；在限制性核酸内切酶的作用下快速剪切核酸适配体，获得所需的目标片段。
实施例1中的选择性定位探针的序列如seq.id.no2所示，具体为ccaaattacccagcctaccagactcacgtttttcgtgagt，其中gactcacg与对应的cgtgagt互补配对，缺少g对应的互补碱基c，而从形成一个不完整的茎。甲基苯丙胺适配体被选择性定位探针剪切后得到以下目标片段序列：5’-acggttgcaagt(seq.id.no3)。传统的探针，在开口处需要额外的一对碱基稳定探针结构，保证对目标序列的有效探针，且剪切速率较慢，需要5-6分钟完成剪切，不对称探针结构更稳定，剪切速率更快，1分钟就能完成剪切。
不同浓度的甲基苯丙胺溶液重复上次操作得到不同浓度甲基苯丙胺检测的实时荧光如图2所示，检测结果表明甲基苯丙胺浓度越小，被置换下来的目标序列越多，等温扩增反应的速率越快，出峰时间就越短。
扩增反应中，目标序列浓度越大，同时和模板dna互补形成的双链结构就越多，在经过扩增后可以得到更多的双链，双链结构越多，sybrgreeni与双链结合越多，荧光强度变化的就越快，表现在实时荧光图中就是最先出现荧光信号，这也说明了荧光的强弱不会影响检测信号。定性检测中，将剪切得到的目标序列和水进行平行试验，水作为对照组，若目标序列的出峰时间远小于水的出峰时间，则说明mta含量较少，反之则含量越多。定量检测:根据实验得到的曲线，可作为标准曲线，将实际测得的出峰时间与标准曲线中的出峰时间对比，估计mta的浓度。
由于核酸适配体具有良好的特异性，所以本发明的检测方法也具有良好的特异性，磁珠介导实现了复杂体系中目标物快速分离、检测信号自适应放大。基于此本发明可以成功检测浓度低达10-13m的甲基苯丙胺溶液。
实施例2
为了考察本发明方法在复杂生物样本中的实际应用情况，考察了在血清中甲基苯丙胺的检测情况。
以检测毒品甲基苯丙胺为例，本发明首先通过磁珠介导在磁珠表面修饰核酸适配体，用生物素修饰适配体，取10μl10-5m的适配体溶液加入90μl的水中得到10-6m的适配体溶液100μl，待用。取10μl浓度为10-6m的适配体溶液，25μl直径为1μm的链霉亲和素修饰的磁珠溶液，5μl20×pbs溶液，以及60μl的水，混合均匀，在室温下孵育30分钟，通过链霉亲和素和生物素的特异性结合把甲基苯丙胺适配体接到磁珠表面，将得到的磁珠-适配体溶液用1×pbs清洗3遍，再用100μl1×pbs溶液溶解，得到磁珠-适配体溶液。将与适配体互补的选择性定位探针spp和限制性内切酶rease混合并孵育30分钟，得到spp-rease混合溶液。在冰上分别配置expar反应的预混合液a和b，预混合液a中包含dntps，nebuffer3.1和expar扩增模板，预混合液b中含有sybrgreeni，bst2.0warmstartdnapolymerase，切口内切酶nt.bstnbi和水，a与b混合配置等温扩增溶液。配置基于血清的浓度为10-9m至10-13m的甲基苯丙胺-血清溶液溶四组(浓度分别为10-9m、10-10m、10-11m、10-12m)。
取25μl上述磁珠-适配体溶液，加入甲基苯丙胺-血清溶液在室温下孵育30分钟。
孵育后的溶液由微流控芯片的样品进样口引入，同时取10.5μl的spp-rease混合溶液由反应溶液进样口1引入，流控模块操控驱动泵阀控制两路液体的流速，使二者在混合区均匀混合5分钟。升温至55度，使spp与适配体结合，剪切酶绑定到spp上，发生特异性剪切。混合后的溶液流入磁分离区，磁控模块控制其内部电磁线圈产生磁场，吸附磁珠留在磁分离区。不含磁珠的混合溶液带着目标核酸片段进入等温扩增区，此时从反应溶液进样口2引入200μl的等温扩增溶液，使二者在等温扩增区混合进行等温扩增反应60分钟，并以30秒的间隔监测等温扩增区的实时荧光。整个过程中温控模块保持混合区、磁分离区、等温扩增区为55℃恒温，温控精度为±1℃。
不同浓度的甲基苯丙胺-血清溶液重复上次操作得到不同浓度甲基苯丙胺检测的实时荧光如图3所示，检测结果表明甲基苯丙胺浓度越小，被置换下来的目标序列越多，等温扩增反应的速率越快，出峰时间就越短。由于核酸适配体具有良好的特异性，所以本发明的检测方法与装置也具有良好的特异性，磁珠介导实现了复杂体系中目标物快速分离、检测信号自适应放大。并且本发明方法在复杂的人体体液样本中检测效果良好，可以成功检测浓度低达10-12m的甲基苯丙胺-血清溶液。
序列表
<110>浙江大学
<120>一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>39
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
acggttgcaagtgggactctggtaggctgggtaatttgg39
<210>2
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ccaaattacccagcctaccagactcacgtttttcgtgagt40
<210>3
<211>12
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acggttgcaagt12