生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术：
：(-)-α-红没药醇是一种不饱和的倍半萜醇，主要存在于巴西桉树(eremanthuserythropappus)和德国洋甘菊(matricariarecutita)的精油中。(-)-α-红没药醇由于具有良好的抗炎、抗菌、防腐和保湿等特性，在口腔卫生产品和皮肤护理产品中得到了广泛应用，目前已被添加用于雅诗兰黛、倩碧等大牌护肤品中。美国食品药品管理局(fda)已经批准将(-)-α-红没药醇作为一种安全成分，在漱口水、护肤品、沐浴露等多种日化产品中安全添加使用(waltimotetal.,archoralbiol.2013,58:10-6)。目前(-)-α-红没药醇主要由化学合成法和植物提取法两种方法获得，由于(-)-α-红没药醇结构异常复杂，导致其化学合成步骤繁琐，且后续手性拆分困难，目前其主要通过巴西桉树蒸馏提取获得。但由于资源的有限性，巴西桉树的数量正在急剧减少，所以使用巴西桉树进行蒸馏提取(-)-α-红没药醇的方法不仅不能满足人们的需要，而且是不可持续的。因此，为了满足人们对(-)-α-红没药醇的需求，亟需发展一种高效的可持续制造方法，来填补市场缺口，造福人类健康。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能够高效合成(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌。本发明再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产(-)-α-红没药醇中的应用。本发明的目的采用如下技术方案实现：生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌，所述重组解脂耶氏酵母菌是在解脂耶氏酵母菌基因组中插入了(-)-α-红没药醇合成酶、法尼基焦磷酸合成酶和3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒后得到的。所述重组解脂耶氏酵母菌是在解脂耶氏酵母菌基因组中插入了3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒和融合蛋白表达盒；所述融合蛋白是由(-)-α-红没药醇合成酶、连接肽和法尼基焦磷酸合成酶组成的。优选的技术方案中，所述连接肽为ggggs或gsg或eaaak。优选的技术方案中，所述表达盒的启动子为解脂耶氏酵母菌的ptefin启动子或ptef1启动子；所述终止子为解脂耶氏酵母菌的txpr2终止子。优选的技术方案中，所述重组解脂耶氏酵母菌还表达1个或多个标记基因；所述标记基因选自3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒或乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒。优选的技术方案中，所述(-)-α-红没药醇合成酶的编码基因如seqidno.1所示；所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶的编码基因序列如seqidno.2所示。本发明还提供生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒、(-)-α-红没药醇合成酶表达盒和法尼基焦磷酸合成酶表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。本发明还提供生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒和融合蛋白表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤；所述融合蛋白是由(-)-α-红没药醇合成酶、连接肽和法尼基焦磷酸合成酶组成的。本发明还提供所述重组菌在生产(-)-α-红没药醇中的应用，包括如下步骤：(1)采用发酵培养基培养权利要求1-9中任一所述重组菌，得到发酵产物；(2)有机溶液萃取所述发酵产物，收集有机相。本发明的重组解脂耶氏酵母菌能够表达(-)-α-红没药醇合成酶、过表达内源法尼基焦磷酸合成酶和3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶，实验证明该重组解脂耶氏酵母菌能够高效发酵生产(-)-α-红没药醇，实现了天然产物(-)-α-红没药醇在解脂耶氏酵母菌中的合成，本发明的重组解脂耶氏酵母菌具有以下优点：(1)本发明构建的重组解脂耶氏酵母菌，是基于敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母菌株，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母菌自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入基因的遗传稳定性。该重组解脂耶氏酵母菌构建方法高效，操作简单。(2)解脂耶氏酵母菌是一种含油酵母，其本身具有很强的油脂合成能力，目标产物(-)-α-红没药醇易溶于脂溶性环境，这为(-)-α-红没药醇在解脂耶氏酵母体内生产提供良好的胞内环境。(3)重组解脂耶氏酵母菌通过过表达3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶编码基因thmg、法尼基焦磷酸合成酶编码基因erg20和(-)-α-红没药醇合成酶编码基因optbbs，实现了(-)-α-红没药醇的高效合成。附图说明图1是重组质粒puc-leu-a08-optbbs的结构图，其中a08-up表示a08位点上游序列，a08-dm表示a08位点下游序列，xpr2t表示终止子，tefin表示启动子。图2显示了重组质粒puc-huh-intc-thmg的结构其中intc-up表示intc位点上游序列，intc-dm表示intc位点下游序列，xpr2t表示终止子，tefin表示启动子。图3显示了重组质粒puc-huh-scp2-erg20的结构,其中scp2-up表示scp2位点上游序列，scp2-dm表示scp2位点下游序列，xpr2t表示终止子，tefin表示启动子。图4是重组菌3生产的(-)-α-红没药醇的gc检测图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。yarrowialipolyticapo1fδku70(mata,△ku70::hisg,leu2-270,ura3-302,xpr2-322,axp1-2)为解脂耶氏酵母菌，敲除了负责非同源重组的编码基因ku70,购于美国菌种保藏中心。a08位点整合质粒是将yarrowialipolyticapo1fδku70基因组中染色体a上a08位点上游2521bp、下游2031bp的序列插入puc57-leu载体(构建方法见实施例1)中所得，leu表达盒在a08位点上下游序列之间。intc位点整合质粒是将yarrowialipolyticapo1fδku70基因组中染色体c上intc位点上游1402bp和下游1396bp的序列插入puc57-hisg-ura-hisg(构建方法见实施例1)载体中所得，两个hisg标签编码基因在intc位点上、下游序列之间。scp2位点整合质粒是将yarrowialipolyticapo1fδku70基因组中染色体e上的scp2位点上游1523bp、下游1524bp的序列插入puc57-hisg-ura-hisg载体中所得。实施例1、基因元件的扩增与目标质粒的制备(一)目标基因的制备根据ncbi上提供的(-)-α-红没药醇合成酶编码基因mrbbs的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的(-)-α-红没药醇合成酶编码基因optbbs，并插入质粒puc57中，得到质粒puc57-optbbs。optbbs的核苷酸序列如seqidno.1所示。根据ncbi上提供的yarrowialipolytica中的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leu的核苷酸序列(m37309.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成leu，将3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒插入质粒puc57中，得到质粒puc57-leu。根据ncbi上提供的yarrowialipolytica中的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因ura的核苷酸序列(genebank登录号aj306421.1)和hisg标签(genebank登录号af324729.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，将两个hisg标签编码基因序列插入质粒puc57中，在两个hisg标签编码基因序列中插入乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒，以便实现ura标记回收，得到质粒puc57-hisg-ura-hisg。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，以thmg-f(seqidno.5)和thmg-r(seqidno.6)为引物扩增3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶编码基因thmg。thmg的核苷酸序列如seqidno.2所示。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，以erg20-f(seqidno.7)和erg20-r(seqidno.8)为引物扩增法尼基焦磷酸合成酶编码基因erg20(genebank登录号yali0e05753g)。启动子ptefin的核苷酸序列如seqidno.3所示，终止子txpr2核苷酸序列如seqidno.4所示。(二)重组质粒的构建1、重组质粒puc-leu-a08-optbbs的构建重组质粒puc-leu-a08-optbbs是以puc57-leu为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70中a08位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了optbbs基因表达盒，3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒在该上下游同源臂之间，结构如图1。以a08-tefinp-f(seqidno.9)和tefinp-optbbs-r(seqidno.10)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增optbbs表达盒启动子ptefin。以optbbs-xpr2t-f(seqidno.11)和a08-xpr2t-r(seqidno.12)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板扩增optbbs表达盒终止子txpr2。以质粒puc57-optbbs为模板，以tefinp-optbbs-f(seqidno.13)和optbbs-xpr2t-r(seqidno.14)为引物，扩增两端分别带有启动子ptefin和终止子txpr2同源臂的optbbs基因。上述pcr反应中所用pcr酶为宝日医生物技术(北京)有限公司的primestarmaxdna聚合酶。上述pcr扩增体系如下：组分体积primerstarmaxpremix25ul模板1ulprimer12ulprimer22ul蒸馏水20ul上述pcr的程序如下：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复30个循环。用takaraminibestdnafragmentpurificationkit(购自上海百赛生物技术股份有限公司)纯化回收各片段。将a08位点整合质粒通过用neb公司的限制性内切酶snabi酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化a08位点整合质粒。将线性化a08位点整合质粒和本实施例标题1构建的optbbs基因表达盒中的各元件利用南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpressmultisonestepcloningkit实现一步克隆，反应体系见下表。将反应体系在37℃孵育30min后，得到环状的重组载体，在a08位点的上下同源臂之间插入了optbbs基因表达盒和3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒(筛选标记)。一步克隆的体系如下表：组分体积5×cemultisbuffer4ulexnasemultis2ul线性化载体xng插入片段yng蒸馏水补足体积至10ul线性化载体(x)、插入片段(y)的使用量可由下面公式计算获得：每片段或线性化载体的最适使用量＝[0.02×片段或线性化载体的碱基对数]ng。将环状的重组载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落pcr及测序验证，得到阳性重组质粒puc-leu-a08-optbbs。2、重组质粒puc-huh-intc-thmg的构建重组质粒puc-huh-intc-thmg是以puc57-hisg-ura-hisg为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70中intc位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了thmg表达盒，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间，具体结构见图2。以intc-tefinp-f(seqidno.15)和tefinp-thmg-r(seqidno.16)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增thmg表达盒启动子ptefin。以thmg-xpr2t-f(seqidno.17)和intc-xpr2t-r(seqidno.18)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增thmg表达盒终止子txpr2。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，以tefinp-thmg-f(seqidno.19)和thmg-xpr2t-r(seqidno.20)为引物扩增两端分别带有启动子ptefin和终止子txpr2同源臂的thmg基因。用neb公司的限制性内切酶pac1对intc位点整合质粒进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化intc位点整合质粒。将线性化intc位点整合质粒和本实施例标题2构建的thmg基因表达盒中的各元件利用南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpressmultisonestepcloningkit实现一步克隆，得到重组质粒puc-huh-intc-thmg。3、重组质粒puc-huh-scp2-erg20的构建重组质粒puc-huh-scp2-erg20是以puc57-hisg-ura-hisg为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70中scp2位点处上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了erg20表达盒，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因表达盒也在上下游同源臂之间。以scp2-tefinp-f(seqidno.21)和tefinp-erg20-r(seqidno.22)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增erg20表达盒启动子ptefin。以erg20-xpr2t-f(seqidno.23)和scp2-xpr2t-r(seqidno.24)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增erg20表达盒终止子txpr2。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，以tefinp-erg20-f(seqidno.25)和erg20-xpr2t-r(seqidno.26)为引物，扩增两端分别带有启动子ptefin和终止子txpr2同源臂的erg20基因。用neb公司的限制性内切酶hindiii对scp2位点整合质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化scp2位点整合质粒。将线性化scp2位点整合质粒和本实施例标题3构建的erg20基因表达盒中的各元件利用南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpressmultisonestepcloningkit实现一步克隆，得到重组质粒puc-huh-scp2-erg20。4、puc-leu-a08-optbbs-gsg-erg20的构建重组质粒puc-leu-a08-optbbs-gsg-erg20是以puc57-leu为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70中a08位点的上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了融合蛋白optbbs-gsg-erg20的表达盒，3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒也在该上下游同源臂之间。融合蛋白optbbs-gsg-erg20的n端为(-)-α-红没药醇合成酶，c端为法尼基焦磷酸合成酶，(-)-α-红没药醇合成酶与法尼基焦磷酸合成酶之间以氨基酸序列为gsg的连接肽相连。以a08-tefinp-f(seqidno.9)和tefinp-optbbs-r(seqidno.10)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增optbbs-gsg-erg20表达盒启动子ptefin。以erg20-xpr2t-f(seqidno.23)和a08-xpr2t-r(seqidno.12)为引物，以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，扩增optbbs表达盒终止子txpr2。以质粒puc57-optbbs为模板，以tefinp-optbbs-f(seqidno.13)和optbbs-erg20-r(seqidno.28)为引物，扩增optbbs基因。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，以optbbs-erg20-f(seqidno.27)和erg20-xpr2t-r(seqidno.26)为引物扩增erg20基因。a08位点整合质粒通过用neb公司的限制性内切酶snabi酶切后，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化a08位点整合质粒。将本实施例标题4扩增获得的optbbs-gsg-erg20表达盒中各基因元件和线性化a08位点整合质粒利用南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpressmultisonestepcloningkit实现一步克隆，得到重组质粒puc-leu-a08-optbbs-gsg-erg20。5、重组质粒puc-leu-a08-erg20-gsg-optbbs的构建重组质粒puc-leu-a08-erg20-gsg-optbbs是以puc57-leu为骨架，插入了a08位点(yarrowialipolyticapo1fδku70)的上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了融合蛋白erg20-gsg-optbbs的表达盒，3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒也在该上下游同源臂之间。融合蛋白erg20-gsg-optbbs的n端为法尼基焦磷酸合成酶，c端为(-)-α-红没药醇合成酶，法尼基焦磷酸合成酶与(-)-α-红没药醇合成酶之间以氨基酸序列为gsg的连接肽相连。以a08-tefinp-f(seqidno.9)和tefinp-erg20-r(seqidno.22)为引物，以yarrowialipolyticaδku70基因组为模板，扩增erg20-gsg-optbbs表达盒的启动子ptefin。以optbbs-xpr2t-f(seqidno.11)和a08-xpr2t-r(seqidno.12)为引物，以yarrowialipolyticaδku70基因组为模板，扩增erg20-gsg-optbbs表达盒的终止子txpr2。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组为模板，以tefinp-erg20-f(seqidno.25)和erg20-optbbs-r(seqidno.29)为引物，扩增erg20基因。以带有合成的optbbs基因的质粒puc57-optbbs为模板，以erg20-optbbs-f(seqidno.30)和optbbs-xpr2t-r(seqidno.14)为引物，扩增optbbs基因。用neb公司的限制性内切酶snabi酶切a08位点整合质粒，经琼脂糖凝胶电泳后胶回收线性化a08位点整合质粒。将本实施例标题5扩增获得的erg20-gsg-optbbs表达盒中各基因元件和线性化a08位点整合质粒，利用南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpressmultisonestepcloningkit实现一步克隆，得到重组质粒puc-leu-a08-erg20-gsg-optbbs。表1各重组质粒中插入序列表2引物序列实施例2重组菌的构建(一)重组菌1的构建(1)将含有optbbs基因表达盒的质粒puc-leu-a08-optbbs导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，optbbs表达盒整合到基因组a08位点处，得到重组菌1。具体方法如下：(1)yarrowialipolyticapo1fδku70于ypd液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。(2)利用zymoresearchcorporation的zymogenfrozenezyeasttransformationkitii将puc-leu-a08-optbbs转化yarrowialipolyticapo1fδku70，进行同源重组。(3)采用筛选培养基sd-leu筛选,将pcr鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌1。其中筛选培养基sd-leu含有：葡萄糖20g/l，yeastnitrogenbase(ynb，酵母氮碱硫酸铵)6.7g/l，csm-leu0.67g/l，琼脂粉23g/l。(二)重组菌2的构建将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-huh-scp2-erg20导入重组菌1，thmg表达盒整合至基因组intc位点，erg20表达盒整合至基因组scp2位点，得到重组菌2。具体方法如下：将重组菌1于ypd液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态，利用zymoresearchcorporation的zymogenfrozenezyeasttransformationkitii将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-huh-scp2-erg20转化入重组菌1中，进行同源重组，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，将pcr鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌2。其中筛选培养基sd-leu-ura的成分为：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，csm-leu-ura0.67g/l，琼脂粉23g/l。(三)重组菌3的构建将puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-optbbs-gsg-erg20质粒导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，thmg表达盒整合至基因组中intc位点，optbbs-gsg-erg20表达盒整合至a08位点，得到重组菌3。具体方法如下：将yarrowialipolyticapo1fδku70于ypd液体培养基(含有2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态，利用zymoresearchcorporation的zymogenfrozenezyeasttransformationkitii将puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-optbbs-gsg-erg20转化yarrowialipolyticapo1fδku70，进行同源重组，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，将pcr鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌3。筛选培养基sd-leu-ura的成分为：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，csm-leu-ura0.67g/l，琼脂粉23g/l。(四)重组菌4的构建将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-erg20-gsg-optbbs导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，thmg表达盒整合至基因组中intc位点，erg20-gsg-optbbs表达盒整合至a08位点，得到重组菌4。具体方法如下：将yarrowialipolyticapo1fδku70于ypd液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态，利用zymoresearchcorporation的zymogenfrozenezyeasttransformationkitii将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-erg20-gsg-optbbs转化yarrowialipolyticapo1fδku70，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，pcr鉴定出正确的阳性克隆，得到重组菌4。其中筛选培养基sd-leu-ura的成分为：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，csm-leu-ura0.67g/l，琼脂粉23g/l。(五)重组菌5-8的构建以质粒puc57-optbbs和yarrowialipolyticapo1fδku70基因组dna为模板，用表4(表4-1、4-2、4-3、4-4)的引物分别进行pcr扩增，得到不同引物对应的含有不同同源臂的optbbs和erg20片段；再分别将不同的引物对应的扩增产物进行一步克隆组成融合蛋白表达盒质粒，将该载体中融合蛋白所含两酶之间的连接肽gsg分别替换成ggggs、eaaak。将上述质粒同puc-huh-intc-thmg质粒转入yarrowialipolyticapo1fδku70中进行同源重组，分别得到重组菌5-8。以带有合成的optbbs基因的质粒puc57-optbbs为模板，以表4(表4-1、4-2、4-3、4-4)中连接肽为ggggs/eaaak的各对引物optbbs-f和optbbs-r进行pcr扩增optbbs基因，得到对应于引物对seqidno.31和seqidno.32、引物对seqidno.31和seqidno.35、引物对seqidno.39和seqidno.40、引物对seqidno.42和seqidno.40的optbbs扩增片段。以yarrowialipolyticapo1fδku70基因组为模板，以表4(表4-1、4-2、4-3、4-4)中连接肽为ggggs/eaaak的各对应引物erg20-f和erg20-r进行pcr扩增erg20基因，得到对应引物对seqidno.33和seqidno.34、引物对seqidno.36和seqidno.34、引物对seqidno.37和seqidno.38、引物对seqidno.37和seqidno.41扩增的erg20片段。利用一步克隆分别将不同引物对对应的optbbs扩增片段和erg20扩增片段作为融合蛋白表达盒元件构建重组质粒puc-leu-a08-optbbs-ggggs-erg20、puc-leu-a08-optbbs-eaaak-erg20、puc-leu-a08-erg20-ggggs-optbbs、puc-leu-a08-erg20-eaaak-optbbs。重组质粒puc-leu-a08-optbbs-ggggs-erg20是以puc57-leu为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70a08位点的上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了融合蛋白optbbs-ggggs-erg20的表达盒，负责合成亮氨酸的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒也在该上下游同源臂之间。融合蛋白optbbs-ggggs-erg20的n端为(-)-α-红没药醇合成酶，c端为法尼基焦磷酸合成酶，(-)-α-红没药醇合成酶法与法尼基焦磷酸合成酶之间以氨基酸序列为ggggs的连接肽相连。重组质粒puc-leu-a08-optbbs-eaaak-erg20是以puc57-leu为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70a08位点的上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了融合蛋白optbbs-eaaak-erg20的表达盒，负责合成亮氨酸的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒在该上下游同源臂之间。融合蛋白optbbs-eaaak-erg20的n端为(-)-α-红没药醇合成酶，c端为法尼基焦磷酸合成酶，(-)-α-红没药醇合成酶与法尼基焦磷酸合成酶之间以氨基酸序列为eaaak的连接肽相连。重组质粒puc-leu-a08-erg20-ggggs-optbbs是以puc57-leu为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70a08位点的上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了融合蛋白erg20-ggggs-optbbs的表达盒，负责合成亮氨酸的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒在该上下游同源臂之间。融合蛋白erg20-ggggs-optbbs的n端为法尼基焦磷酸合成酶，c端为(-)-α-红没药醇合成酶，法尼基焦磷酸合成酶与(-)-α-红没药醇合成酶之间以氨基酸序列为ggggs的连接肽相连。重组质粒puc-leu-a08-erg20-eaaak-optbbs是以puc57-leu为骨架，插入了yarrowialipolyticapo1fδku70a08位点的上下游同源臂，在该上下游同源臂之间插入了融合蛋白erg20-eaaak-optbbs的表达盒，负责合成亮氨酸的3(β)-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因表达盒在该上下游同源臂之间。融合蛋白erg20-eaaak-optbbs的n端为法尼基焦磷酸合成酶，c端为(-)-α-红没药醇合成酶，法尼基焦磷酸合成酶与(-)-α-红没药醇合成酶之间以氨基酸序列为eaaak的连接肽相连。将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-optbbs-ggggs-erg20导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，进行同源重组，thmg表达盒整合至基因组intc位点处，optbbs-ggggs-erg20表达盒整合至基因组a08位点处，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，将pcr鉴定正确的阳性克隆命名为重组菌5。将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-optbbs-eaaak-erg20导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，进行同源重组，thmg表达盒整合至基因组intc位点处，optbbs-eaaak-erg20表达盒整合至基因组a08位点处，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，将pcr鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌6。将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-erg20-ggggs-optbbs导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，进行同源重组，thmg表达盒整合至基因组intc位点处，erg20-ggggs-optbbs表达盒整合至基因组a08位点处，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，将pcr鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌7。将重组质粒puc-huh-intc-thmg和puc-leu-a08-erg20-eaaak-optbbs导入yarrowialipolyticapo1fδku70中，进行同源重组，thmg表达盒整合至基因组中intc位点，erg20-eaaak-optbbs表达盒整合至a08位点，采用筛选培养基sd-leu-ura筛选，将pcr鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌8。表3为连接肽核苷酸序列和氨基酸序列氨基酸序列核苷酸序列(5'→3')ggggsggcggtggtggctccgsgggttctggteaaakgaagctgccgccaaa表4-1为构建重组质粒puc-leu-a08-optbbs-ggggs-erg20所需引物表4-2为构建重组质粒puc-leu-a08-optbbs-eaaak-erg20所需引物表4-3为构建重组质粒puc-leu-a08-erg20-ggggs-optbbs所需引物表4-4为构建重组质粒puc-leu-a08-erg20-eaaak-optbbs所需引物实施例3、重组菌1-8在生产(-)-α-红没药醇中的应用1、工程菌的培养及产物提取分别采用实施例2中重组菌1-8生产(-)-α-红没药醇。具体方法如下：活化重组菌，于ypd液体培养基中30℃、220rpm条件下培养16h，得到种子液。将种子液以1％的接种量接种于50ml发酵培养基中，在30℃、220rpm震荡培养1天，然后加入发酵液体积10％的正十二烷，继续震荡培养3天。发酵结束后，将发酵液转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，收集有机相备用。其中发酵培养基含有55g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物和20g/l胰蛋白胨。2、(-)-α-红没药醇的定性定量分析将各重组菌发酵液中的有机相过有机尼龙滤膜(0.22um)，用gc检测。检测条件：进样口温度250℃，进样体积1ul，不分流；色谱柱：hp-5ms(30m*0.25mm)；色谱条件：初始温度为60℃，按照10℃/min的速度上升到160℃，然后5℃/min上升到200℃，最后10℃/min上升到230℃。用(-)-α红没药醇的标准品进行定性定量。图4为重组菌3生产的(-)-α-红没药醇的gc检测图。发酵5天后，重组菌3和重组菌4的(-)-α-红没药醇产量最高，达到了120mg/l，即每升发酵液产120mg的(-)-α-红没药醇。重组菌1、重组菌2、重组菌5、重组菌6、重组菌7、重组菌8产量分别为76mg/l、98mg/l、83mg/l、67mg/l、103mg/l和70mg/l。sequencelisting<110>南京工业大学<120>生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用<130>20190325<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>1719<212>dna<213>artificial<220><223>optbbs<400>1atgtctaccctctccgtgtccactccttccttctcctcctcccccctctcttccgtgaac60aaaaactccaccaagcagcacgtcacccgaaactccgtgatcttccatgactctatctgg120ggcgaccagttcctcgaatataaagagaagtttaatgtcgctactgaaaagcagctgatc180gaggaactcaaggaggaggtccgaaacgaactcatgatccgagcttgcaacgaggcctcc240cgatacattaaactcatccagctgatcgacgtcgtggaacgactgggcctcgcttatcac300ttcgagaaggagatcgaagagtccctccaacacatctacgtcacctacggccacaagtgg360accaactacaacaacatcgagtctctctctctctggtttcgactcctccgacagaacggt420ttcaacgtgtcttccgatatctttgaaaaccatatcgacgaaaagggcaactttcaagaa480tctttatgcaacgacccccaaggtatgctggctttatacgaggccgcctacatgagagtc540gagggtgagatcattttagataaggccctcgagtttaccaagctgcacctcggcatcatt600tctaacgacccctcttgcgattcctctctgcgaactgagatcaagcaagctttaaaacag660cctctccgacgaagactgcctcgactggaggccgtccgatatatcgctatttaccagcag720aaggcctcccactctgaggttttactcaagctcgctaaactggactttaacgtgctccaa780gaaatgcacaaggatgagctgtcccagatctgcaaatggtggaaggacctcgacatccga840aacaagctcccctacgtcagagaccgactgattgagggctacttctggattttaggcatc900tactttgagccccagcactcccgaacccgaatgtttttaatgaagacttgtatgtggctc960atcgttttagacgacacctttgacaactacggcacttacgaggagctggagatcttcacc1020caagctgtcgagcgatggtccatcacttgtctggacgagctgcccgagtacatgaagctc1080atctaccatgagcagttccgagtccatcaagagatggaggagtccctcgagaaagagggc1140aaggcctaccagatccattacatcaaagagatggccaaggagggcactcgatccttatta1200ctggaggccaagtggctgaaggagggttatatgcccaccctcgacgagtacctctccaac1260tctttagtcacttgtggctacgctctcatgactgccagatcttacgtcgctcgagacgat1320ggtatcgtgaccgaggacgctttcaaatgggtcgctactcacccccctatcgtgaaggcc1380gcttgtaagattctccgactcatggacgacatcgccacccataaggaggagcaagaacga1440ggccacatcgcctcttctatcgagtgctacagaaaggagaccggcgcctctgaggaggag1500gcttgcatggactttctcaagcaagttgaagatggctggaaggtcattaaccaagaatct1560ctcatgcctaccgacgtgcccttccccttattaattcccgctatcaacctcgcccgagtg1620tccgacactttatataaagacaacgacggctacaatcacgccgataaggaggtgatcggc1680tacatcaagtccctcttcgtccaccctatgattgtgtaa1719<210>2<211>1503<212>dna<213>yarrowialipolyticapo1fδku70<400>2atgacccagtctgtgaaggtggttgagaagcacgttcctatcgtcattgagaagcccagc60gagaaggaggaggacacctcttctgaagactccattgagctgactgtcggaaagcagccc120aagcccgtgaccgagacccgttctctggacgacctagaggctatcatgaaggcaggtaag180accaagcttctggaggaccacgaggttgtcaagctctctctcgagggcaagcttcctttg240tatgctcttgagaagcagcttggtgacaacacccgagctgttggcatccgacgatctatc300atctcccagcagtctaataccaagactttagagacctcaaagcttccttacctgcactac360gactacgaccgtgtttttggagcctgttgcgagaacgttattggttacatgcctctcccc420gttggtgttgctggccccatgaacattgatggcaagaactaccacattcctatggccacc480actgagggttgtcttgttgcctcaaccatgcgaggttgcaaggccatcaacgccggtggc540ggtgttaccactgtgcttactcaggacggtatgacacgaggtccttgtgtttccttcccc600tctctcaagcgggctggagccgctaagatctggcttgattccgaggagggtctcaagtcc660atgcgaaaggccttcaactccacctctcgatttgctcgtctccagtctcttcactctacc720cttgctggtaacctgctgtttattcgattccgaaccaccactggtgatgccatgggcatg780aacatgatctccaagggcgtcgaacactctctggccgtcatggtcaaggagtacggcttc840cctgatatggacattgtgtctgtctcgggtaactactgcactgacaagaagcccgcagcg900atcaactggatcgaaggccgaggcaagagtgttgttgccgaagccaccatccctgctcac960attgtcaagtctgttctcaaaagtgaggttgacgctcttgttgagctcaacatcagcaag1020aatctgatcggtagtgccatggctggctctgtgggaggtttcaatgcacacgccgcaaac1080ctggtgaccgccatctaccttgccactggccaggatcctgctcagaatgtcgagtcttcc1140aactgcatcacgctgatgagcaacgtcgacggtaacctgctcatctccgtttccatgcct1200tctatcgaggtcggtaccattggtggaggtactattttggagccccagggggctatgctg1260gagatgcttggcgtgcgaggtcctcacatcgagacccccggtgccaacgcccaacagctt1320gctcgcatcattgcttctggagttcttgcagcggagctttcgctgtgttctgctcttgct1380gccggccatcttgtgcaaagtcatatgacccacaaccggtcccaggctcctactccggcc1440aagcagtctcaggccgatctgcagcgtctacaaaacggttcgaatatttgcatacggtca1500tag1503<210>3<211>531<212>dna<213>yarrowialipolyticapo1fδku70<400>3agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgac60cccaaattgacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttcaccccacatatca120aacctcccccggttcccacacttgccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatcta180cgcttgttcagactttgtactagtttctttgtctggccatccgggtaacccatgccggac240gcaaaatagactactgaaaatttttttgctttgtggttgggactttagccaagggtataa300aagaccaccgtccccgaattacctttcctcttcttttctctctctccttgtcaactcaca360cccgaaatcgttaagcatttccttctgagtataagaatcattcaaaatggtgagtttcag420aggcagcagcaattgccacgggctttgagcacacggccgggtgtggtcccattcccatcg480acacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtactaaccgcag531<210>4<211>516<212>dna<213>yarrowialipolyticapo1fδku70<400>4gatccaactacggaacttgtgttgatgtctttgcccccggctccgatatcatctctgcct60cttaccagtccgactctggtactttggtctactccggtacctccatggcctgtccccacg120ttgccggtcttgcctcctactacctgtccatcaatgacgaggttctcacccctgcccagg180tcgaggctcttattactgagtccaacaccggtgttcttcccaccaccaacctcaagggct240ctcccaacgctgttgcctacaacggtgttggcatttaggcaattaacagatagtttgccg300gtgataattctcttaacctcccacactcctttgacataacgatttatgtaacgaaactga360aatttgaccagatattgttgtaaatagaaaatctggcttgtaggtggcaaaatcccgtct420ttgttcatcaattccctctgtgactactcgtcatccctttatgttcgactgtcgtatttt480tattttccatacatacgcaagtgagatgcccgtgtc516当前第1页12