一种酚类污染物降解菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物降解技术领域，尤其涉及一种酚类污染物降解菌及其应用。

背景技术：

酚类化合物作为有机化学工业的基本原料被广泛应用于酚醛树脂、杀虫剂、染料、农药和医药的生产中。酚类化合物属于毒性很强的有机污染物，是环境中主要的污染物之一，苯酚、间甲酚、2，4-氯酚、2，4，6-氯酚、五氯酚及对硝基酚六种酚类污染物已被列入中国水环境优先控制污染“黑名单”。地表水中酚类化合物主要来自炼油、煤气洗涤、炼焦、造纸、合成氨、木材防腐和化工等工业废水。处理含酚废水的方法很多,其中生物降解法是一种经济有效且无二次污染的方法,许多学者在这方面进行了大量研究，生物降解的关键在于获取高效的酚降解菌株。

近年来国内外针对酚类物质生物降解方面开展了大量的研究工作，现已发现许多对酚类物质具有降解作用的菌株，如文献“张海涛,刘文斌,杨海君,等.一株耐盐高效苯酚降解菌的筛选、鉴定、响应面法优化与降酚动力学研究[j].环境科学学报,2016,36(9):3200-3207”中记载不动杆菌在苯酚浓度为800mg/l的情况下72小时，对苯酚的降解率达到93.23％；文献“张安龙.一株高效苯酚降解真菌的分离鉴定及其菌剂的制备[j].微生物学通报,2018,45(7):1450-1461”中记载magnusiomycescapitatus真菌28小时对1600mg/l苯酚的最大去除率达到97.15％，再如文献“jiangy,shangy,yangk,etal.phenoldegradationbyhalophilicfungalisolatejs4andevaluationofitstoleranceofheavymetals[j].appliedmicrobiology&biotechnology,2016,100(4):1883-1890”中记载嗜盐真菌js4在最佳条件下32小时可完全降解500mg/l苯酚，虽然上述已报道的菌株在试验条件下对酚类物质有一定的降解能力，但是其在多种有机碳源环境中(有机废水和酚类污染土壤环境)对酚类物质降解效率低。

技术实现要素：

为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种酚类污染物降解菌及其应用，该酚类污染物降解菌能在多种碳源环境中高效降解酚类污染物。

为实现上述目的，本发明的一种酚类污染物降解菌，酚类污染物降解菌为嗜联苯红球菌，菌株命名为嗜联苯红球菌b403(rhodococcusbiphenylivoransb403)，其保藏编号为cctccno：m2019087，保藏日期为2019年1月25日。

一种酚类污染物降解菌的应用，其特征在于，所述酚类污染物降解菌为嗜联苯红球菌，菌株命名为嗜联苯红球菌b403(rhodococcusbiphenylivoransb403)，其保藏编号为cctccno：m2019087，保藏日期为2019年1月25日，所述嗜联苯红球菌b403在微生物降解酚类化合物中的应用。

作为优选方案，所述酚类化合物为苯酚、间甲酚、邻苯二酚中的一种或多种。

作为优选方案，所述嗜联苯红球菌b403在多碳源环境中降解酚类化合物。

作为优选方案，所述多碳源环境采用lb-无机盐混合培养基进行模拟，所述lb-无机盐混合培养基为lb培养基和无机盐培养基按1:1混合配制而成，lb培养基的具体组分为酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l；无机盐培养基的具体组分为nacl0.2g/l、nh4no31g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、kh2po40.5g/l、k2hpo40.5g/l、feso4·7h2o0.01g/l。

本发明的优点在于：与现有的酚类污染物降解菌相比，本发明通过梯度富集驯化的培养方法得到一株能够在多种碳源环境中高效降解酚类污染物菌株，菌株命名为嗜联苯红球菌b403(rhodococcusbiphenylivoransb403)，相比于以酚类化合物为单一碳源的环境，嗜联苯红球菌b403在多种机碳源存在的环境中表现出更高的酚类污染物降解效率。

附图说明

图1a为嗜联苯红球菌b403在平板上的菌落形态图；

图1b为嗜联苯红球菌b403在显微镜下的细胞形态图；

图2为嗜联苯红球菌b403进化树图；

图3a为嗜联苯红球菌b403在不同碳源条件下的苯酚降解曲线图；

图3b为嗜联苯红球菌b403在不同碳源条件下的间甲酚降解曲线图；

图3c为嗜联苯红球菌b403在不同碳源条件下的邻苯二酚降解曲线图。

图4a为原核转录组测序流程图；

图4b为基因表达水平相关性图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。

为解决现有酚类污染物降解菌在多种碳源环境中对酚类物质降解效率低的问题，本发明提供一种酚类污染物降解菌及其应用，具体地说，利用梯度富集驯化的培养方法，从湖北省孝昌县污水处理厂曝气池中分离筛选出一株能够高效降解酚类污染物的菌株，菌株命名为嗜联苯红球菌b403(rhodococcusbiphenylivoransb403)，其保藏编号为cctccno：m2019087，保藏日期为2019年1月25日；相比于以酚类化合物为单一碳源的环境，嗜联苯红球菌b403在多种机碳源存在的环境中表现出更高的酚类污染物降解效率。

实施例1：酚类降解菌株的筛选

(一)材料

活性污泥样本取自湖北省孝感市孝昌县污水处理厂曝气池。

lb培养基：酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l。

无机盐培养基：nacl0.2g/l、nh4no31g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、kh2po40.5g/l、k2hpo40.5g/l、feso4·7h2o0.01g/l。

lb-无机盐混合培养基：lb培养基与无机盐培养基1：1混合。以上培养基均在121℃蒸汽灭菌30min。

本实施例中lb培养基和lb-无机盐混合培养基模拟多种碳源环境，无机盐培养基模拟单一碳源环境。

(二)梯度富集驯化培养

将活性污泥按占1％的比例接种到lb液体培养基中，28℃恒温摇床200rpm培养24小时活化。将活化培养的活性污泥培养物按10％的比例转接至含50mg/l苯酚的lb-无机盐混合培养基28℃恒温摇床200rpm培养48小时。上述培养物作为富集培养的种子液，以不同浓度梯度苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中进行富集培养。苯酚无机盐培养基中苯酚浓度梯度按50mg/l、100mg/l、200mg/l、500mg/l、1,000mg/l设置，每个梯度富集培养一周，富集能以苯酚为唯一碳源生长且对高浓度苯酚具有良好耐受性能的菌株，富集培养物用于酚类降解微生物的筛选。

(三)筛选高降解效率的菌株

将经梯度浓度苯酚富集培养的活性污泥培养物稀释涂布在含500mg/l苯酚的无机盐培养基平板，28℃培养。在无机盐培养基上筛选得到约30个单菌落。挑选单菌落接种至含800mg/l苯酚的无机盐液体培养基中在28℃恒温培养72小时后，按5％的接菌量接种至50ml含1000mg/l苯酚的无机盐液体培养基中，继续恒温培养72小时。菌株在培养基中驯化72小时后，取5％菌液继续接入50ml含1000mg/l苯酚的无机盐液体培养基中，连续传代驯化培养30天经过复筛，并经高浓度苯酚耐受性测试，分离纯化得到7株能以苯酚为唯一碳源生长且对苯酚有较好耐受性的菌株。分别对7株菌株进行苯酚降解效率的测定，苯酚降解效率的测定方法为：称取0.5g苯酚用100ml容量瓶定容，得到5g/l苯酚母液，取母液至培养基中使苯酚的初始浓度500mg/l，用lb液体培养基活化菌株，控制接种后培养基中的初始od600＝0.1，于28℃，200rpm振荡培养，每隔3h取样1ml培养液至ep管中，12000rpm离心5min后取上清液，用双蒸水将上清液稀释50倍，经过0.22μm的有机相微孔滤膜过滤，滤液用hplc分析测定其苯酚含量，分析菌株对苯酚的降解效率，从7株菌株中选取苯酚降解效率最高的一株菌株，命名为嗜联苯红球菌b403。

(四)嗜联苯红球菌b403形态观察

嗜联苯红球菌b403菌落呈圆形、橙色、边缘整齐、中间隆起、湿润有光泽、较黏稠(如图1a)；革兰氏染色呈现阳性，16×100倍油镜观察，细胞呈现短棒状或球状(如图1b)。

实施例2：嗜联苯红球菌b403的分子鉴定

(一)嗜联苯红球菌b403的16srdna序列扩增

正向引物：碱基序列如seqidno.1所示

反向引物：碱基序列如seqidno.2所示。

pcr扩增体系：总体积为50μl，其中擎科金牌扩增mix46μl，正向引物(10pmol/μl)1μl，反向引物(10pmol/μl)1μl，基因组dna2μl。

扩增程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，30个循环，72℃最终延伸2min，4℃保存。

16srdna测序委托武汉擎科伟业生物科技有限公司进行。使用ncbi的blast工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)与已知核酸序列进行比对，将同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为送检样品的种属，选择同源性较高的已知16srdna序列通过mega软件构建进化树，结合图2所示，待检菌株的16srdna序列与红球菌属同源性均在97％以上，通过建立系统发育树分析，该菌株与rhodococcusbiphenylivorans亲缘关系最近，因此鉴定该菌株为嗜联苯红球菌(rhodococcusbiphenylivorans)，命名为rhodococcusbiphenylivoransb403。

实施例3：嗜联苯红球菌b403对苯酚、间甲酚、邻苯二酚的降解

(一)嗜联苯红球菌b403对苯酚的降解

嗜联苯红球菌b403分别在含500mg/l苯酚的lb培养基、含500mg/l苯酚的无机盐培养基、含500mg/l苯酚的lb-无机盐混合培养基中测定嗜联苯红球菌b403在多种碳源条件下的苯酚降解效率。

在相同苯酚浓度的lb培养基、无机盐培养基及lb-无机盐混合培养基中，接种相同生物量的嗜联苯红球菌b403，28℃恒温，200rpm震荡培养，每3小时同步取样分析培养液中苯酚的含量，绘制苯酚降解曲线，如图3a所示，测定苯酚降解效率的过程为：每隔3h取样1ml培养液至ep管中，12,000rpm离心5min后取上清液，用双蒸水将上清液稀释50倍，经过0.22μm的有机相微孔滤膜过滤，滤液用hplc分析测定其苯酚含量，分析菌株对苯酚的降解效率。从图3a可以看出，15个小时，在lb-无机盐混合培养基中该菌对苯酚的降解效率最高，降解率可达99％；18小时，在lb-无机盐混合培养基及lb培养基中苯酚降解率达到100％；33小时，在无机盐培养基以及lb-无机盐混合培养基及lb培养基中苯酚降解率达到100％，以上结果表明嗜联苯红球菌b403在多种有机碳源存在的条件下表现出更高的苯酚降解效率。

(二)嗜联苯红球菌b403对间甲酚的降解

嗜联苯红球菌b403分别在含500mg/l间甲酚的lb培养基、含500mg/l间甲酚的无机盐培养基、含500mg/l间甲酚的lb-无机盐混合培养基中测定嗜联苯红球菌b403在多种碳源条件下的间甲酚降解效率。

在相同间甲酚浓度的lb培养基、无机盐培养基及lb-无机盐混合培养基中，接种相同生物量的嗜联苯红球菌b403，28℃恒温，200rpm震荡培养，每3小时同步取样分析培养液中间甲酚的含量，绘制间甲酚降解曲线，如图3a所示，测定间甲酚降解效率的过程为：每隔3h取样1ml培养液至ep管中，12,000rpm离心5min后取上清液，用双蒸水将上清液稀释50倍，经过0.22μm的有机相微孔滤膜过滤，滤液用hplc分析测定其间甲酚含量，分析菌株对间甲酚的降解效率。从图3b可以看出，15个小时，在lb-无机盐混合培养基和lb培养基中间甲酚降解率达到99％，30个小时，在无机盐培养基中该菌对间甲酚降解率达到100％。以上结果表明嗜联苯红球菌b403在多种机碳源存在的条件下表现出更高的间甲酚降解效率。

(三)嗜联苯红球菌b403对邻苯二酚的降解

嗜联苯红球菌b403分别在含500mg/l邻苯二酚的lb培养基、含500mg/l邻苯二酚的无机盐培养基、含500mg/l邻苯二酚的lb-无机盐混合培养基中测定嗜联苯红球菌b403在多种碳源条件下的邻苯二酚降解效率。

在相同邻苯二酚浓度的lb培养基、无机盐培养基及lb-无机盐混合培养基中，接种相同生物量的嗜联苯红球菌b403，28℃恒温，200rpm震荡培养，每3小时同步取样分析培养液中邻苯二酚的含量，绘制邻苯二酚降解曲线，如图3c所示，18个小时在lb-无机盐混合培养基和lb培养基中相同邻苯二酚降解率达到100％，48小时在无机盐培养基中相同邻苯二酚降解率达到67％。以上结果表明嗜联苯红球菌b403在多种有机碳源存在的条件下表现出更高的间甲酚降解效率。

实施例4：嗜联苯红球菌b403在两种不同含苯酚培养基中的差异基因分析

(一)实验流程

如图4a所示，获得样品总rna后，在构建测序文库前，通常会采用qubit和agilent2100检测总rna的浓度和完整性，以确保使用合格的样品进行原核转录组测序。样品检测合格后，使用试剂盒去除样品rrna，然后加入fragmentationbuffer进行片段化处理，再以片段化后的mrna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cdna链，然后加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成第二条cdna链；再经过磁珠纯化并加eb缓冲液洗脱之后做末端修复、加碱基a，并连接测序接头，然后用磁珠进行片段大小选择、降解含u链，并通过pcr富集得到cdna文库，使用建好的测序文库进行原核转录组测序。

(二)分析样品准备

挑取平板保存的嗜联苯红球菌b403单菌落接种至lb培养基中活化36小时，按1％的接菌量接种至含500mg/l苯酚的lb培养基、含500mg/l苯酚的无机盐培养基培养12小时后于4℃离心得到菌体，加pbs溶液重悬离心弃上清，重复三次，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。设置三个生物学重复，含500mg/l苯酚的lb培养基中离心得到的菌体命名为l1、l2、l3；含500mg/l苯酚的无机盐培养基中离心得到的菌体命名为wu1、wu2、wu3。

(三)样品的相关系分析生物学重复样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。相关系数趋于1，则说明生物学重复样品间的表达模式相似度越高。理想条件下要求皮尔逊相关系数的平方大于0.9，但实际项目中我们通常要求其大于0.8，否则需要重新实验或者找到合理的解释。如图4b所示，l1、l2、l3三个生物学重复样品之间相关性较高，最低0.991。wu1、wu2、wu3三个生物学重复样品之间相关性较高，最低0.965。而l系列样品与w系列样品在转录水平上有显著差异，最高为0.924。说明嗜联苯红球菌b403在两种培养基中存在基因表达差异。

(四)基因表达差异分析

差异表达基因是指一个基因在rna水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达量有显著性差异的基因。在差异表达基因检测过程中，通常以fc≥2和fdr≤0.01作为筛选标准。差异倍数(foldchange,fc)表示两样品组间表达量的比值。错误发现率(falsediscoveryrate,fdr)是通过对差异显著性p值(p-value)校正得到。fc越大两样品组间表达量差别越大，fdr约小两样品组间差异越显著。l系列样品与w系列样品总差异表达基因为799个，以|log2fc|≥4为阈值，将|log2fc|≥4的转录本定义为高表达的转录本，对lvsw(w与l表达基因比较)差异表达基因进行基因注释，表达量差异显著的基因共有32个，获得注释的基因有27个。这些基因包括abc转运家族蛋白、生物素合成酶、氨基酸转运蛋白、氧化还原酶、fmn结合蛋白、单加氧酶、谷氨酸脱氢酶、酪氨酸代谢酶、天冬氨酸消旋酶、3-甲基巴豆酰辅酶a羧化酶、异分支酸合成酶、dna结合蛋白、双功能异分支酸裂解酶、芳基载体蛋白、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶、8-氨基-7-氧代壬酸合酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、苯甲醛脱氢酶、3-氧代酸coa-转移酶、水解酶。其中l比w表达量多的基因有10个，包括氨基酸转运蛋白、芳香族氨基酸代谢酶、dna结合蛋白、双加氧酶、氧化还原酶。苯酚的降解与双加氧酶和氧化还原酶密切相关，差异表达基因中表达量最为显著的双加氧酶和氧化还原酶的基因都出现在了l系列样品中，说明了嗜联苯红球菌b403在含苯酚的lb培养基(模拟多种有机碳源的环境)和含苯酚的无机盐培养基(模拟单一有机碳源的环境)中对苯酚的利用有显著差异，进一步为嗜联苯红球菌b403在多种有机碳源存在的条件下表现出更高的苯酚降解效率的效果提供理论基础。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>湖北大学

<120>一种酚类污染物降解菌及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

<210>2

<211>22

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