一种戊型肝炎病毒、培养方法及其灭活疫苗的制备方法与流程

本发明涉及肝炎病毒技术领域，尤其涉及戊型肝炎病毒、培养方法及其灭活疫苗的制备方法。

背景技术：

戊型肝炎病毒(hepatitisevirus，hev)，是一种经粪口途径传播，严重危害人类健康的病毒性肝炎病原体。目前，全世界已有约三分之一的人口感染hev，其中孕妇感染hev后死亡率高达20％-25％。2015年who报道显示，仅亚洲和非洲的9个地区就有近2010万人感染hev，每年死亡人数到达30万，其中7万人死于hev感染所引发的重症肝炎，并造成5200胎儿死亡。中国是戊肝高发地区之一，其中1986年在新疆大规模爆发，导致119280例感染，死亡707例。2013年全国重点传染病疫情分析报告表明，病毒性肝炎仍占据甲乙类传染病中发病率的首位，其中hev名列传染病致死率的前10位，成为我国急性流行性肝炎中的最大杀手。

近年大量临床报道发现戊肝感染可导致慢性化，并在短期内造成肝硬化。更严重的是，戊肝已经证实是一种人畜共患病，生吃猪肉、猪肝，或饮用生牛奶都会导致人类感染hev，极大的增加了hev感染的风险。因此，迫切需要对hev疫苗进行深入的研发。

目前戊肝病毒没有有效的治疗方法。由于hev缺乏有效的细胞培养体系，阻碍了传统全病毒疫苗的研究。尽管2012年厦门大学针对hev基因1研制出世界上首支hev基因工程疫苗“益可宁”，但与我国主要流行基因4型存在一定的差异，并且目前市面上仍无商品化的疫苗出售。此外，由于该重组疫苗只表达hev基因1型的部分衣壳蛋白，因此其对我国主要流行的基因4型的保护性还有待进一步的评价。而传统的全病毒疫苗不仅保留了病毒刺激机体免疫系统的特性，并且是以完整的病原体作为抗原，具有所有新型基因重组疫苗所不可替代的优势。因此，在hev可培养的基础上，传统的全病毒疫苗将会是预防hev最好的策略。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题提，本发明提供一种制备戊型肝炎灭活疫苗的新的戊型肝炎病毒(命名为km01)及其培养方法，该毒株可以在vero细胞上稳定增殖，且动物实验已经证实km01具有良好的免疫原性，可以用作生产疫苗的毒种。用该病毒km01生产戊型肝炎灭活疫苗不仅在安全性方面更可靠，而且具有良好的免疫原性和保护效果，此毒株是生产戊型肝炎灭活疫苗的理想毒株。还提供了利用该病毒制备灭活疫苗的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种戊型肝炎病毒，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

一种戊型肝炎病毒的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)从戊型肝炎急性感染猪粪便中分离得到病毒，经生物学特性鉴定确认为戊型肝炎病毒；

(b)在vero细胞上盲传适应6代，并仍具有较高的病毒滴度(>10⁷)；

(c)在vero上培养适应过程中逐渐减少培养时间，早代次培养周期为23天，传至10代后病毒繁殖周期由23天缩短到7天；其中，每次培养期满后，将细胞于-80℃反复冻融3次，获得病毒-细胞培养悬液，置-80℃保存备用；

(d)通过蚀斑纯化，获得3株较为单一的hev克隆株，经pcr和透射电镜鉴定为hev病毒颗粒，在前6代核苷酸序列中未发现有义氨基酸突变，遗传稳定性较好；

(e)排除hev阳性的克隆中其他肠道病毒群的感染；

(f)最终获得一株所需的戊型肝炎病毒，该病毒于-80℃保藏，命名为km01。

一种戊型肝炎灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(a)在含有2-10％胎牛血清的dmem培养基中培养vero细胞，使细胞浓度达到10⁶-10⁷/ml；

(b)将戊型肝炎病毒接种到上述细胞浓度的细胞基质培养基中，35.5-37.5℃孵育2-3h，后补加含有2％胎牛血清的dmem培养基，置35.5-37.5℃培养；

(c)将细胞于-60℃至-80℃反复冻融3-5次，获得病毒-细胞培养悬液；

(d)经浓缩纯化、灭活后获得戊型肝炎灭活疫苗。

进一步的，所述dmem培养基ph为6.8-7.4。

进一步的，所述vero细胞为自液氮容器内取出经1000rmp离心10min，弃去原保存液后得到的vero细胞。

进一步的，所述步骤(d)的具体过程是如下：用10％peg和0.4m的nacl溶液浓缩，10000rpm离心60min，弃上清，收集沉淀；将收集的沉淀用10μmol/lpbs悬浮后，12000rmp离心30min，弃沉淀，收集上清；经1.5g/ml氯化铯38000rpm梯度离心5h，弃上清，收集沉淀；将收集的沉淀用10μmol/lpbs悬浮，之后柱层析进一步去除残余dna和杂蛋白，得到的病毒用250μg/ml的甲醛37℃灭活15天，每毫升病毒加0.5mg氢氧化铝佐剂和5μg苯氧乙醇防腐剂，得到戊型肝炎灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

本发明采用戊型肝炎病毒km01株与vero细胞培养系统，可进行新型高效精制戊肝灭活疫苗(vero细胞)的生产，并且，病毒产率高，为大幅度降低生产成本，制备有效、廉价的戊肝灭活疫苗提供了保障。另外，本发明的疫苗为高纯度灭活疫苗，使戊肝灭活疫苗的安全性、有效性得以保证。

附图说明

下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

图1是本发明戊型肝炎病毒毒株km01蚀斑实验纯化结果；

图2是本发明戊型肝炎病毒毒株km01的pcr鉴定结果；

图3是本发明戊型肝炎病毒毒株km01透射电镜图；

图4是本发明hev阳性的克隆进行肠道病毒a群检测结果；

图5是本发明hev阳性的克隆进行肠道病毒b群检测结果；

图6是本发明hev阳性的克隆进行肠道病毒c群检测结果；

图7是本发明戊型肝炎病毒灭活疫苗免疫小鼠后小鼠血清elisa结果。

具体实施方式

本发明的疫苗生产方法使得能利用vero细胞工业化大规模生产。

戊型肝炎灭活疫苗，从技术根本上解决了戊型肝炎病毒抗原难于大量获取的问题。采用本发明的戊型肝炎病毒km01毒株、vero细胞基质及相应的方法能大量获取戊肝病毒抗原。与其他戊肝毒株、细胞基质及其工艺技术相比，本发明方法中病毒繁殖的细胞基质为vero细胞，是世界卫生组织(who)准允用于制备人用生物制品的细胞基质。与二倍体细胞相比，vero细胞具有易培养，并可满足用发酵罐(微载体技术)大规模生产等明显优势，vero细胞现己被国内外广泛用于生产人用精制狂犬疫苗、乙脑疫苗等升级换代产品。另外，本发明的km01毒株具有在vero细胞上高效稳定增殖的特性；动物试验己证明km01株具有良好的免疫原性。

在本发明的戊型肝炎灭活疫苗的制备方法中：

步骤(a)细胞基质为vero细胞，该细胞培养基为含10％胎牛血清的dmem培养基，培养温度通常为35.5-37.5℃。

步骤(b)的培养基为含2％胎牛血清的dmem培养基，培养温度通常为35.5-37.5℃。

步骤(d)的纯化病毒制备疫苗可采用本领域常规的方法，例如可采用如下方法进行：首先，将选择经步骤(b)细胞于-60℃至-80℃反复冻融3-5次，获得病毒-细胞培养悬液。随后8000rmp离心30-50min，收集上清。用10％peg(分子量6000)和0.4m的nacl溶液浓缩，10000rpm离心50-80min，弃上清，收集沉淀。将收集的沉淀用pbs悬浮后，12000rmp离心30-50min，弃沉淀，收集上清。经1.5g/ml氯化铯38000rpm梯度离心5-8h，弃上清，收集沉淀。将收集的沉淀用pbs悬浮，之后柱层析进一步去除残余dna和杂蛋白。得到的病毒用250μg/ml甲醛37℃灭活15-20天。每毫升加0.5-1mg氢氧化铝佐剂和5-8μg苯氧乙醇防腐剂，由此制成戊型肝炎灭活疫苗。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的分子生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例1：戊型肝炎病毒毒株km01的培养方法

(a)从戊型肝炎急性感染猪粪便中分离得到病毒，经生物学特性鉴定确认为戊型肝炎病毒。

(b)在vero细胞上盲传适应6代，并仍具有较高的病毒滴度(>10⁷)。

(c)在vero上培养适应过程中逐渐减少培养时间。早代次培养周期为23天，传至10代后病毒繁殖周期由23天缩短到7天。其中，每次培养期满后，将细胞于-80℃反复冻融3次，获得病毒-细胞培养悬液，置-80℃保存备用。

(d)通过蚀斑纯化，获得3株较为单一的hev克隆株(参见图1)，经pcr和透射电镜鉴定为hev病毒颗粒(参见图2和图3)，在前6代核苷酸序列中未发现有义氨基酸突变，遗传稳定性较好。

(e)并已经排除hev阳性的克隆中其他肠道病毒a、b、c群的感染(参见图4、图5和图6)。

(f)最终获得一株所需的戊型肝炎病毒毒株，命名为km01，该毒株于-80℃保藏。

实施例2：戊型肝炎灭活疫苗的制备

自液氮容器内取出vero细胞，1000rmp离心10min，弃去原保存液，加入含有10％胎牛血清的dmem培养基，置37℃培养至细胞长成单层，用pbs洗涤，胰酶消化，加入上述培养基，继续传代培养，直至获得足够细胞。

将上述细胞培养于浓度达到106/ml时，在ph7的培养基中加入实施例1获得的戊型肝炎病毒毒株km01，于37℃培养7天。培养期满后，将细胞于-80℃反复冻融3次，获得病毒-细胞培养悬液。随后8000rmp离心30min，收集上清。用10％peg(分子量6000)和0.4m的nacl溶液浓缩，10000rpm离心60min，弃上清，收集沉淀。将收集的沉淀用10μmol/lpbs悬浮后，12000rmp离心30min，弃沉淀，收集上清。经1.5g/ml氯化铯38000rpm梯度离心5h，弃上清，收集沉淀。将收集的沉淀用10μmol/lpbs悬浮，之后柱层析进一步去除残余dna和杂蛋白。得到的病毒用250μg/ml的甲醛37℃灭活15天。每毫升病毒加0.5mg氢氧化铝佐剂和5μg苯氧乙醇防腐剂，由此制成戊型肝炎灭活疫苗。

实施例3：将甲醛灭活的病毒液免疫小鼠

将经本发明实施例1、实施例2制备的戊型肝炎灭活疫苗免疫小鼠，进行小鼠体内效力测试，计算半数有效稀释倍数

一、材料

1、经本发明实施例1、实施例2制备的戊型肝炎灭活疫苗

2、氢氧化铝佐剂、生理盐水

3、实验动物

spf级balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

二、实验方法

用疫苗稀释液将灭活疫苗原液进行2倍系列稀释，共4个稀释度：原液、1：2、1：4和1：8。将spf级balb/c小鼠随机分成4组，每组12只。

第一组：6只注射150μl灭活疫苗原液+150μl生理盐水；6只尾静脉注射150μl灭活疫苗原液+150μl氢氧化铝佐剂。

第二组：6只尾静脉注射150μl1：2稀释的灭活疫苗+生理盐水；6只尾静脉注射150μl1：2稀释的灭活疫苗+氢氧化铝佐剂。

第三组：6只尾静脉注射150μl1：4稀释的灭活疫苗+生理盐水；6只尾静脉注射150μl1：4稀释的灭活疫苗+氢氧化铝佐剂。

第四组：6只尾静脉注射150μl1：8稀释的灭活疫苗+生理盐水；6只尾静脉注射150μl1：8稀释的灭活疫苗+氢氧化铝佐剂。

连续免疫3次，每次间隔28天。从第一次免疫后定期尾静脉采血，离心分离血清，-20℃保存备用。随后用elisa法检测抗hev抗体。

三、结果

将经本发明实施例1、实施例2制备的戊型肝炎灭活疫苗免疫小鼠，第二次加强免疫后100％受试动物血清转阳性，攻毒实验证实免疫后的动物对hev具有100％的保护性(参见图7、表1、表2和表3)，并且抗体持续存在9个月仍具有较好的保护性。动物攻毒试验证实km01株具有良好的免疫原性。

表1戊型肝炎病毒灭活疫苗第一次免疫小鼠效力实验结果

表2戊型肝炎病毒灭活疫苗第二次免疫小鼠效力实验结果

表3戊型肝炎病毒灭活疫苗第三次免疫小鼠效力实验结果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种戊型肝炎病毒、培养方法及其灭活疫苗的制备方法

<130>2019.02.28

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>7264

<212>dna

<213>hepatitisevirus

<400>1

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