一种克鲁维乳酸酵母CVE-LT1及其在葡萄酒酿造中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域。本发明具体涉及一种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1及其在葡萄酒酿造中的应用。

背景技术：

新疆地区酿酒酵母种植面积广大，已发展成为我国仅次于渤海湾产区重要的优质酿酒葡萄和葡萄酒生产基地。深居内陆，远离海洋，特殊地理和高热、少雨、日照时间长的气候环境使新疆具备栽培与酿造优质葡萄和葡萄酒的自然环境，而且新疆葡萄主产区几乎与法国优质葡萄产区多处于同一纬度。但是由于该地区日温差大、降雨量少等气候特点，造成了酿酒葡萄原料具有含糖量过高，酸度较低，香气物质积累不足的特点。含糖量过高，抑制酵母菌生长，造成葡萄酒中的酒精含量过高，对葡萄酒的口感影响很大；酸度过低则会使葡萄酒颜色黯淡无光，口感单调、不清新；而葡萄本身香气积累不足会直接影响到最终葡萄酒的香气品质，所以这些缺点亟待合理地解决。对于新疆地区的地理气候特点，我们很难通过人为的手段改变。但是通过合理规划参与酒精发酵的菌种类型及接种方式能够最大程度地解决新疆地区葡萄酒酸度低，香气较差的缺陷。

葡萄酒是经破碎或未破碎的新鲜葡萄浆果或葡萄汁经过完全或部分酒精发酵后获得的饮料，其酒精度不能低于8.5(％v/v)。发酵剂的优劣对葡萄酒的品质产生举足轻重的作用。葡萄酒酵母一般可分为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和非酿酒酵母(non-saccharomycescerevisiae)两大类。其中，酿酒酵母主要是将葡萄汁中的糖类转化为酒精和co2，抑制有害菌种的生长，保证顺利完成酒精发酵的整个过程，同时分泌一定量的甘油和大量的使人愉悦的风味物质，比如高级醇、醛、酯等物质。而非酿酒酵母存在于葡萄园土壤、葡萄表皮以及葡萄酒酿造环境中，包括葡萄酒酿造厂房、容器等，它能够产生大量的甘油、酯类等代谢产物，并且能够产生一些酶将葡萄酒中的香气前体物质分解从而释放出香气物质，对葡萄酒的风味产生积极影响。非酿酒酵母种类众多，如克勒克氏酵母(kloeckera)、假丝酵母(candida)、毕赤酵母(pichia)、汉逊酵母(hanseniaspora)、梅奇酵母(metschnikowia)、红酵母(rhodotorula)、有孢圆酵母(torulaspora)等。在葡萄酒发酵过程中，非酿酒酵母可以产生果胶酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶等，使其具有一定的胞外酶活性，这些酶作用于葡萄汁中的相关底物中，进而影响葡萄酒的组成成分及风味物质。

近年来，对于酿酒酵母的研究日渐完善，研究的范围也不断扩大。相关研究表明，在葡萄酒自然发酵过程初期，不仅有酿酒酵母的存在，也有大量的非酿酒酵母存在。在葡萄酒发酵过程中，酵母菌的种与种之间存在一定的相互作用，这种复杂的相互作用会对葡萄酒的发酵效率和最终品质产生极其重要的影响。随着研究的进一步发展，研究人员发现非酿酒酵母具有提升葡萄酒中乳酸含量，改善葡萄酒香气及口感，提高葡萄酒颜色等诸多优点。不同种属的非酿酒酵母与酿酒酵母的混合发酵更能带来一些酿酒酵母单独发酵所不具有的优点。因此，近年来对非酿酒酵母的研究一直是葡萄酒研究的热点。

在众多的非酿酒酵母当中，我们发现耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotolerans(kluyveromyceslactis)的生长能力和对于酒精的耐受力较强，在酒精发酵的末期依旧存在。除此之外，该酵母能够明显地增加葡萄酒中乳酸的含量，使葡萄酒的平衡性更好。这种增加乳酸含量的酵母能够一定程度上解决新疆地区葡萄酒酸度较低的缺陷，使得新疆产区葡萄酒的品质有进一步的提升。也有研究证明，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotolerans能够增加葡萄酒的花果类香气物质。但是国内葡萄酒行业对于耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotolerans的研究很少，相关优良酵母的储备非常不足，亟待获得可应用于实际生产的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotolerans。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株能够提升葡萄酒香气及乳酸含量且具有实际应用潜力的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1。

本发明的另一目的是提供上述耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在增加葡萄酒酸度中的应用酿造葡萄酒中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2018年1月8日，保藏编号为cgmccno.15161。

所述耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够在10摄氏度的低发酵温度下生长。

所述耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够在大于50ppm的高二氧化硫浓度下保持良好的生长活性。

一种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在葡萄酒酿造中的应用。

采用耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母的混合发酵；其中，先接种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1，再接种酿酒酵母。

所述应用能够增加葡萄酒的酸度。

所述应用能够改善葡萄酒的香气。

所述耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够提高葡萄酒中的乳酸的含量。

所述耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够提高葡萄酒中的高级醇及酯类香气物质的含量。

所述酿酒酵母为商业酿酒酵母ec1118；其中，先接种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1，间隔四天后接种酿酒酵母ec1118。

该应用中，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1通过提高乳酸的含量增加葡萄酒的酸度，乳酸的含量达到8.68g/l。

耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1通过提高葡萄酒中苯乙醇和甘油的含量提升葡萄酒的香气。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够提升葡萄酒的乳酸含量，并且一定程度上改善葡萄酒最终的香气，提升葡萄酒的花香及果香。适用于葡萄本身酸度较低的产区，并且能够提升葡萄酒的香气品质。尤其适用于新疆地区。

附图说明

图1为本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在不同二氧化硫浓度和温度下的产酸情况；

图2为本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母混合发酵质量变化情况；

图3-1为酿酒酵母单独发酵实验中菌种的生长情况；

图3-2为本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母混合发酵的同时发酵实验中菌种的生长情况；

图3-3为本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母混合发酵的两天实验中菌种的生长情况；

图3-4为本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母混合发酵的四天实验中菌种的生长情况；

图4为本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在混合发酵中各菌种的形态。

其中，附图标记为：

1、周围白色边缘2、中间淡绿色突起

3、边缘白色透明圆环4、墨绿色中部

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明。

除非特别指明，以下实施例中所用的方法均为常规方法。

实施例中涉及的培养基成分组成如下：

biggy琼脂培养基：柠檬酸铋铵，5g/l；亚硫酸钠，3g/l；葡萄糖，10g/l；甘氨酸，10g/l；酵母浸粉，10g/l；琼脂，1g/l。

酵母营养培养基(ypd)：酵母浸粉，10g/l；蛋白胨，20g/l；葡萄糖，20g/l；琼脂，20g/l。

蛋白酶筛选培养基：酵母浸粉，10g/l；蛋白胨，20g/l；葡萄糖，20g/l；琼脂，20g/l；脱脂奶粉，20g/l。

ynb营养缺陷培养基：ynb，6.7g/l；纤维二糖，5g/l；琼脂，20g/l。

无碳源的ynb培养基：硫酸5.0g/l；生物素2.0μg/l；泛酸钙400.0μg/l；叶酸2.0μg/l；肌醇2,000.0μg/l；烟酸400.0μg/l；对氨基苯甲酸200.0μg/l；吡哆醇盐酸盐400.0μg/l；核黄素200.0μg/l；盐酸硫胺素400.0μg/l；硼酸500.0μg/l；硫酸铜40.0μg/l；碘化钾100.0μg/l；氯化铁200.0μg/l；硫酸锰400.0μg/l；钼酸钠200.0μg/l；硫酸锌400.0μg/l；磷酸一钾1.0g/l；硫酸镁0.5g/l；氯化钠0.1g/l；氯化钙0.1g/l。

本发明的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15161，保藏时间为2018年1月8日。

耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1菌株特性初步检测实验

本实验的对照组菌株为保藏编号为cgmccno.12349的酿酒酵母cve-sc45。

分别进行以下初步检测实验，得到表1的结果：

1、高渗耐受性筛选：通过含糖量的差异来造成渗透压的差异，进而判断菌种的高渗耐受性。在葡萄汁中加入葡萄糖，使最终含糖量为400g\l。使用装有15ml上述葡萄汁的50ml离心管作为发酵容器，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1菌株和酿酒酵母cve-sc45在其中培养5天，温度为24℃。5天后，测定葡萄汁od600值来检测酵母的生长情况。葡萄汁在使用前进行巴氏灭菌，从而保证单菌种发酵。

2、硫化氢产量筛选：通过分别观察接种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1菌株和酿酒酵母cve-sc45后biggy琼脂培养基颜色的变化来判断酵母的硫化氢产量。酵母接种到灭菌后的biggy琼脂培养基中，经过30℃，5天的培养，观察培养基的颜色。

3、二氧化硫耐受性筛选：亚硫酸钾在葡萄汁中分解从而产生二氧化硫。设定的葡萄汁中二氧化硫的浓度梯度为0、25、50、100ppm。使用50ml离心管作为发酵容器，每个离心管中装有15ml具有上述二氧化硫的浓度的葡萄汁。两种酵母菌株分别在发酵容器中培养5天，温度为24℃。5天后，分别测定葡萄汁od600值来分别检测酵母菌株的生长情况。

4、糖苷酶活性筛选：通过ynb营养缺陷培养基进行糖苷酶的测定。具体步骤如下：

1)菌株活化：从保藏管中吸出约1ml的酵母菌液，放入约7ml的ypd培养基中，30℃摇床活化1天左右。

2)消耗多余的糖：从活化后的酵母菌液中吸取1ml加入到无碳源的ynb培养基中，在30℃的条件下摇床培养大约6h，直至将剩余的糖消耗完。

3)转接到ynb营养缺陷培养基：酵母菌液5μl加入到ynb培养基中，置于30℃下，培养24-48h。

4)观察：观察平板中菌落的生长状况，评判标准是：生长状况越好代表其糖苷酶活性越强。

5、蛋白酶活性筛选：通过蛋白酶筛选培养基进行菌种蛋白酶活性的筛选。培养基灭菌完毕后与2％灭菌后脱脂奶粉等体积混合。将适量的菌种接种到蛋白酶筛选培养基中，30摄氏度培养5天。具有透明圆环的菌种具有蛋白酶活性。

6、低温耐受性筛选：通过菌种在低温下的生长情况判断其低温耐受性。使用50ml离心管作为发酵容器，其中装有15ml巴氏灭菌后的葡萄汁。将酵母菌种接种到葡萄汁中，在10℃的培养箱中培养5天，通过测定od600值来检测酵母菌种的生长情况。

表1-1耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母cve-sc45基本特性对比

表1-2耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母cve-sc45二氧化硫耐受性对比

从表1-1和表1-2中可以看出，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够在10摄氏度的发酵温度下生长，具有低温发酵的潜力，也可以用于发酵前期的冷浸渍时期。另外，该菌种能够在大于50ppm的较高的二氧化硫浓度下保持良好的生长活性，符合葡萄酒生产中菌种的基本要求。但是表1中的其它基础特性并不明显，还需要进一步确定其实际酿造的情况。

耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1单独发酵实验

为进一步确定耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在葡萄汁中的发酵能力，对其进行单独发酵实验。

本实验的对照组菌株分别为商业酿酒酵母ec1118以及保藏编号为cgmccno.12349的酿酒酵母cve-sc45。

取适量葡萄汁(使用2016年采摘自河北昌黎的赤霞珠葡萄，还原糖含量为226g/l，ph值为3.16，可滴定酸总量为5.13g/l)进行巴氏灭菌(79℃，15min)。

将耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1、酿酒酵母cve-sc45以及商业酿酒酵母ec1118分别接种于上述已巴氏灭菌葡萄汁中。将30ml葡萄汁置于50ml离心管中，24℃下静置发酵12天。在酒精发酵期间，取第6天和第12天的发酵液保存，用于其测定主要代谢产物。

按照下述方法分析发酵液的主要代谢产物：

发酵液过滤(pes，0.22μm)后，采用高效液相色谱hplc1200(agilenttechnologies,inc.paloalto,ca)进行发酵主要代谢产物分析。离子交换色谱柱为hpx-87haminexion-exchangecolumn(300×7.8mm，美国bio-radlaboratories)，流动相为5mm的h2so4溶液,等度洗脱，流速0.6ml/min。

葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的测定使用示差折光检测器(rid，refractiveindexdetector，g1362a，美国agilent)，进样量为20μl，柱温45℃，分析时间30min；有机酸(酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸和乙酸)的测定采用二极管阵列检测器(dad，photodiodearraydetector，g1315d，美国agilent)，进样量为10μl，柱温60℃，分析时间25min。

表2-1酵母发酵液主要的理化指标

表2-2酵母发酵液主要的理化指标

为了更加准确地评价耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1的发酵特性，选取中期(6天)和末期(12天)的发酵液进行测定，结果如表2-1和表2-2所示。相比于酿酒酵母cve-sc45单独发酵的结果，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够明显地增加乳酸的含量，其末期的发酵液中乳酸含量是酿酒酵母发酵液的9倍左右。另外，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1还低产乙酸，这也表明其具有良好的葡萄酒酿造潜力。除乙酸含量外，其它有机酸的含量与酿酒酵母cve-sc45差别不大。除此之外，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够高产甘油，能够改善葡萄酒的口感，提高适口性。虽然耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1不能够单独完成酒精发酵。但是剩余糖的含量较低，采用混合发酵的方式能够保证顺利地完成整个酒精发酵过程。综上所述，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1单独发酵充分展示了该酵母优良的酿造特性，特点鲜明，潜力巨大。

耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1模拟发酵实验

由于该酵母巨大的应用潜力，我们进一步模拟了其在实际生产中的可能面临的发酵环境，主要针对其二氧化硫耐受性和低温耐受性。实际发酵中微生物种类和数量复杂，需要二氧化硫抑制其他杂菌。这就需要参与酒精发酵的酵母具有极强的二氧化硫耐受性。但是二氧化硫还是会影响酵母的一些生长，其代谢产物的含量也会有一定的变化。因此不同二氧化硫浓度下耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1的代谢情况需要进一步确定，主要是乳酸的含量。

设置两个二氧化硫浓度梯度：0ppm和60ppm。其中，60ppm的二氧化硫浓度是葡萄酒企业实际酿造常用的浓度。目前葡萄酒企业还普遍采用冷浸渍的方式提高葡萄酒的多酚及香气含量，这就突出了酵母的对低温耐受的重要性。如果酵母具有较高的低温耐受性，就能够提前一步生长代谢，其代谢产物的含量也会有一定的提升。但是，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在低温条件下的代谢情况却不清楚。因此，设置10℃(冷浸渍)和23℃(常温)两个温度梯度，测定其乳酸含量的变化情况。

本实验采用商业酿酒酵母ec1118作为对照。

发酵方法为：在250ml锥形瓶中装有200ml巴氏灭菌的葡萄汁，各发酵罐以发酵栓封口，接种酵母10天后，结束酒精发酵。

发酵液的主要代谢产物的分析方法与单独发酵试验相同。

如图1所示，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1在不同温度和二氧化硫浓度下，柠檬酸和酒石酸的变化不大。低温条件下，琥珀酸、乳酸以及苹果酸的含量都有一定的降低。乳酸在不同的二氧化硫浓度下的含量几乎没有变化。这表明二氧化硫对于乳酸的代谢影响很小。但是在低温条件下，乳酸的含量有一定的下降。即便如此，在不同的温度下，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1实验的乳酸含量依然高于对照组ec1118。

耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1的小规模混合发酵实验

由于耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1不能够独自完成酒精发酵，所以采用与酿酒酵母混合发酵的工艺不可避免。为此，将耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与商业酿酒酵母ec1118进行混合发酵的实验，研究其混合发酵后葡萄酒主要理化指标的变化。

使用250ml的锥形瓶作为发酵容器，其中加入200ml巴氏灭菌后的葡萄汁。按照商业酿酒酵母ec111810⁶cfu/ml，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt110⁷cfu/ml的接种量接入葡萄汁中。共设四个实验组，每组重复三次，具体为：

单独发酵实验组：商业酿酒酵母ec1118单独发酵(ec1118)；

同时发酵实验组：耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与商业酿酒酵母ec1118同时接种发酵(ec1118+cve-lt1)；

两天发酵实验组：耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与商业酿酒酵母ec1118间隔两天进行顺序接种发酵(ec1118+cve-lt1(2天))；其中，先接种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1；

四天发酵实验组：耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与商业酿酒酵母ec1118间隔四天进行顺序接种发酵(ec1118+cve-lt1(4天))；其中，先接种耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1。

各发酵罐以发酵栓封口，24℃条件下静置培养，每天测定发酵容器的二氧化碳失重情况，至含重量低于0.02g/100ml时终止发酵，取发酵液进行测定。发酵过程菌种浓度的测定采用平板菌落计数法(sn/t0168-2015)。

发酵液的主要代谢产物的分析方法与耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1单独发酵实验的分析方法相同。

如图2所示，单独发酵实验组，即商业酿酒酵母ec1118单独发酵的失重速率最快，也反映了其生长速率最快。其次是同时发酵实验组，四天发酵实验组的生长速率最慢。如图3-1、3-2、3-3以及3-4所示，商业酿酒酵母ec1118在各实验组中均能够保证酒精发酵的顺利结束，达到相似的最大菌种浓度(8.3log(cfu/ml))。在混合发酵的实验中，商业酿酒酵母ec1118加入葡萄汁的实验越迟，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1的存在时间越长，最长时间可达到10天。虽然耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1自身的生长能力不弱，但是其生长却被商业酿酒酵母ec1118抑制。这样也一定程度地上保证了酒精发酵的顺利完成。

图4为混合发酵中各菌种的形态。商业酿酒酵母ec1118具有周围白色边缘1和中间淡绿色突起2；耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1具有边缘白色透明圆环3和墨绿色中部4。

表3混合发酵中各实验组的乳酸含量

注：表中数据(平均值±相对标准差)；利用独立样本t检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。

表3表明各实验组最终乳酸含量的差异。从中可以看出，与商业酿酒酵母ec1118单独发酵相比，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1参与的混合发酵实验能够明显提升乳酸的含量，其中ec1118+cve-lt1(4天)组乳酸的含量最高，达到8.68g/l，是使用商业酿酒酵母ec1118单独发酵产生的乳酸的54.25倍。这充分证明了耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1优良的产乳酸能力。

耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1的中试发酵实验。

经过上述四个实验，确定了耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1优良的产酸能力及葡萄酒酿造的应用潜力。但是对于其应用于实际葡萄酒的发酵的能力还需进一步验证。因此，申请人在新疆玛纳斯县进行了耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1的中试发酵实验。所述中试发酵实验的发酵罐为20l不锈钢发酵罐。

首先，取适量葡萄汁(使用2017年采摘自新疆玛纳斯的赤霞珠葡萄，还原糖含量为236g/l，ph值为3.26，可滴定酸总量为5.06g/l)进行巴氏灭菌(79℃，15min)。将保存于-80℃的耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1接种于上述已巴氏灭菌葡萄汁中进行一级扩大培养，待菌体进入对数生长期后转接至二级培养的已巴氏灭菌的葡萄汁中，待菌体生长至对数期后留作种子液备用。

本实验的对照组菌株分别为：商业化的酿酒酵母d254^tm(lalvin,法国)以及商业化的克鲁维酵母concerto^tm(科汉森，丹麦)。这两种酵母在接种时通过30-40℃温水活化，按照产品规定的流程进行操作，保证接种量的准确。

向发酵罐中加入18l破碎后赤霞珠葡萄。按照酿酒酵母10⁶cfu/ml，非酿酒酵母10⁷cfu/ml的接种量接入葡萄汁中。共设4个实验组，每组重复两次，具体为：

d254实验组：酿酒酵母d254单独发酵。

concerto实验组：商业耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleransconcerto与酿酒酵母d254间隔两天进行顺序接种发酵。

lt1/d254(2天)实验组：耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母d254间隔两天进行顺序接种发酵。:

lt1/d254(4天)实验组：耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1与酿酒酵母d254间隔四天进行顺序接种发酵。

记录待发酵液初始数据为初始糖浓度236g/l，二氧化硫浓度60mg/l，ph＝3.26。各发酵罐以发酵栓封口，24摄氏度条件下静置培养12天左右，至含糖量低于4g/l时终止发酵，酿造得到干红葡萄酒。

发酵液的主要代谢产物分析方法与单独发酵实验中的分析方法相同。

发酵液中酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量的测定：用agilent6890气相色谱(gc)和agilent5975质谱(ms)联用仪(agilent，美国)检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱hp-innowaxpolyethyleneglycol60m×0.25mm×0.25μm(j&wscientific，美国)载气为高纯氦气，流速1ml/min；顶空固相微萃取自动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱借口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式ei，离子能量70ev，质量扫描范围20-350m/z。

将5ml发酵样品加入到15ml样品瓶中，同时加入1gnacl、10μl内标(4-甲基-2-戊醇)后迅速用带有聚四氟乙烯(ptfe)隔垫的样品瓶盖拧紧密封，在40℃恒温条件下，180r/min平衡30min。样品瓶中的气-液相香气物质达到平衡后，将已活化或热解析过的聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯(pdms/car/dvb)萃取头插入样品瓶的顶空部分，在40℃恒温下搅拌萃取30min，使样品瓶中的香气物质达到气-固和气-液平衡。然后将萃取头插入gc-ms进样口，250℃热解析8min，不分流进样。

香气物质的定性和定量分析：利用质谱全离子扫描(scan)图谱，对于已有标准品的物质，依据本实验已建立的相同色谱条件下该化合物的保留时间、保留指数和质谱信息进行定性分析，制作其在模拟酒溶液中的标准曲线进行定量(合成酒溶液为2g/l葡萄糖、7g/l酒石酸和12％酒精度的水溶液，naoh调ph至3.3。将混合香气标准品配制成15个梯度)。没有标准品的物质，利用文献报道中相似色谱条件下该化合物的保留指数以及nist11标准谱库(nistchemistrywebbook)比对结果进行半定性分析。

表4酒精发酵后各实验组主要代谢物质含量

注：表中数据(平均值±相对标准差)；利用独立样本t检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。

由表4数据可知，各发酵实验组的基本理化指标均在国标控制范围内，且符合gb15037-2006对干红葡萄酒的各项指标要求。相比于酿酒酵母d254单独发酵，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1参与的混合发酵实验增加了葡萄酒中乳酸、甘油的含量，能够一定程度上提升葡萄酒的口感及其适饮性。同时，酒精的含量也有不同程度的下降，更符合近年来消费者对于酒精饮品的需求。乙酸对葡萄酒的口感和香气产生一定的消极作用，通过加入耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够一定程度上降低葡萄酒中乙酸含量，提升葡萄酒的品质。商业耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleransconcerto的乳酸含量是各实验组中最高的，但是耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1所产的乳酸含量与其没有明显差异。

表5酒精发酵后各实验组香气物质含量

注：表中数据(平均值±相对标准差)；利用独立样本t检验进行显著性方差分析，同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同处理组之间存在的显著性差异(p<0.05)。

如表5所示，相较于酿酒酵母d254和商业耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleransconcerto，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1参与的混合发酵实验能够提升葡萄酒中高级醇及酯类香气物质的含量。酯类香气包括丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、2-乙酸苯乙酯；高级醇类香气包括1-己醇、1-辛醇、1-庚醇、苯乙醇。其中大部分的酯类香气具有花果的香气，如丁酸乙酯具有菠萝、草莓等香气；己酸乙酯具有香蕉、青苹果的香气；辛酸乙酯具有花香和梨的香气。而高级醇类香气物质中大部分具有青草味和植物味，如1-己醇。其中，苯乙醇是一种重要的高级醇类香气，能够带来浓郁的花香和蜜香。通过耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1参与的混合发酵能够提升这些香气物质，进一步证明耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1优良的葡萄酒酿造特性和巨大的实际应用潜力。

综上所述，耐热克鲁维酵母kluyveromycesthermotoleranscve-lt1能够明显地增加葡萄酒中乳酸的含量，并且改善葡萄酒的香气、提升葡萄酒的花果香，使葡萄酒香气更为复杂、浓郁、有层次感。