一种利用蓝藻泥制备活性菌剂的方法与流程

本发明涉及一种利用蓝藻泥制备活性菌剂的方法，属于生物工程技术、饲料添加剂等领域。

背景技术：

淡水湖泊及河流由于富营养造成蓝藻水华，严重影响环境生态和饮用水源，例如太湖蓝藻每年频繁爆发，给当地造成严重危机。目前针对太湖蓝藻主要通过打捞方式进行治理，如2017年打捞近1179万吨，干物质计算约为11万吨。蓝藻干物质中主要含有40～70％的蛋白质和18～25％的多糖类。地方对打捞和蓝藻脱水形成蓝藻泥进行财政补贴，占用大量社会公共资源，因此对蓝藻泥进一步资源化利用技术的开发尤为紧迫。

蓝藻泥资源化比较成熟技术包括堆肥发酵、沼气发酵和生物塑料。但是，蓝藻发酵制成的堆肥与农业种植季节不完全契合；蓝藻含碳较低对沼气发酵不利(需外源补充，如与猪粪共发酵)，形成大量藻渣也无法进一步利用，丢弃造成二次污染；如果作为生物塑料，则售价取决其中蛋白质含量，且制成的塑料有蓝藻臭味。此外还有蓝藻泥水解制备氨基酸，用于叶面肥或饲料添加剂，但是条件苛刻(高温和浓酸)，容易形成二次污染，成本也较高。另外，也有报道蓝藻泥用于培养酵母用于制备单细胞蛋白，但是其中存在的藻毒素是潜在隐患。此外，蓝藻泥也有可用于木霉菌发酵，用作植物、农作物的生防菌剂。

技术实现要素：

本发明充分利用蓝藻泥丰富营养和芽孢杆菌属的丰富酶系，通过添加秸秆进行固态发酵，制备形成无或低藻毒素的微生态菌剂，可应用于畜牧和水产养殖业。同时，秸秆直接来源于畜牧养殖场、农业废弃物，可以进行废弃物再利用。

本发明的第一个目的是提供一种制备微生态菌剂的方法，所述方法以蓝藻泥和秸秆为原料，接种芽孢杆菌属的微生物进行固态发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤包括：

(1)将蓝藻泥与辅料按1:0.5-2.5混合均匀，灭菌，制备固体培养基；

(2)向步骤(1)得到的固体培养基中按每100g接种1～5mlod值为4.5-5.4的芽孢杆菌菌液，于30-37℃发酵，得到微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述芽孢杆菌属的微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蓝藻为微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、伪鱼腥藻、拟柱胞藻、颤藻、浮丝藻、鞘丝藻、节球藻、束球藻中的一种或几种。

进一步地，所述蓝藻泥的含水率为85-95％。

进一步地，所述蓝藻泥是藻水分离站处打捞的新鲜蓝藻泥，或打捞后的于低温保存的蓝藻泥，或经脱水处理后的含水率为50-80％的蓝藻饼。

进一步地，在步骤(1)中，所述辅料为秸秆、麸皮或其组合。

进一步地，在步骤(1)中，所述的灭菌条件为121℃高压蒸汽灭菌30min，在蒸汽灭菌或煮沸等条件下的其他的灭菌条件下均适用。

进一步地，在步骤(1)中，所述的蓝藻固体培养基含有：蓝藻泥30-60份，秸秆、麸皮或其组合40-70份。

进一步地，在步骤(1)中，所述的蓝藻固体培养基还含有葡萄糖及nacl、kh2po3、k2hpo3、mgso4、feso4、gacl2等无机盐中的至少一种。

进一步地，在步骤(1)中，所述的蓝藻固体培养基的含水率为30％-60％。

进一步地，在步骤(2)中，所述的发酵培养时间24-72h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还对步骤(2)获得的微生物菌剂进行烘干。

在本发明的一种实施方式中，烘干后还进行粉粹，获得固态粉末状菌剂。

本发明的第二个目的是提供应用上述任一方法制备获得的微生物菌剂。

本发明还要求保护所述微生物菌剂在制备动物饲料方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述菌剂按照一定比例加入动物饲料中，搅拌，投喂牲畜。

在本发明的一种实施方式中，所述牲畜包括但不限于牛、猪、羊。

有益效果：本发明针对打捞水华蓝藻进行资源化利用，通过将打捞的蓝藻与辅料简单混合灭菌后进行固态发酵，充分利用了蓝藻中含有大量蛋白(40-60％)、多糖等营养组成特点，利用芽孢杆菌配合简单原料进行固态发酵，使发酵后的产物中游离氨基酸总量达1000mg/100g以上，水解氨基酸总量达15.16g/100g同时利用芽孢杆菌的丰富酶系对蓝藻泥中藻毒素mc进行降解，在发酵60h后，培养基中已检测不到藻毒素。

附图说明

图1为藻毒素标品色谱图；

图2为藻毒素标准品质谱图；

图3为发酵0h样品(a)和藻毒素标样(b)的色谱图；

图4为发酵24h样品(a)和藻毒素标样(b)的色谱图；

图5为发酵48h样品(a)和藻毒素标样(b)的色谱图；

图6为发酵60h样品(a)和藻毒素标样(b)的色谱图。

具体实施方式

结合具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步阐明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明使用的芽孢杆菌包括：

1.枯草芽孢杆菌，商业化菌株，编号atcc14579；

2.地衣芽孢杆菌，编号cicimb0109购自江南大学中国高校工业微生物平台。

实施例1芽孢杆菌种子液的制备

本实施例所涉及的培养基：

lb液体培养基配方：向1l蒸馏水中加入5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10gnacl，naoh调ph7.0左右，121℃高压蒸汽灭菌20-30min；

lb固体培养基配方：向1l液体lb培养基中加入15-20g琼脂粉,naoh调ph7.0左右，121℃高压蒸汽灭菌20-30min。

将枯草或地衣芽孢杆菌接种在lb固体培养基上活化，37℃平板培养16-24h后，挑取单菌落接种到lb液体培养基上，37℃、200rpm摇床生长至对数中后期，得到od值在4.5-5.4的芽孢杆菌种子液。

实施例2枯草芽孢杆菌的固态发酵培养

本实施例所用到的蓝藻固体培养基：蓝藻泥(含水率93％)53份、47份秸秆混合均匀，分装到三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到含水率为50％的蓝藻培养基。

将实施例1得到的枯草芽孢杆菌种子液，按体积质量比1％接种到蓝藻培养基上，搅拌均匀后，放置于37℃培养箱内培养48h，间隔进行搅拌，最终芽孢活菌数可达2.6×10⁹cfu/g。

实施例3地衣芽孢杆菌的固态发酵培养

本实施例所用到的蓝藻固体培养基：蓝藻泥(含水率93％)53份、47份秸秆混合均匀，分装到三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到含水率为50％的蓝藻培养基。

将实施例1得到的地衣芽孢杆菌种子液，按体积质量比1％接种到蓝藻培养基上，搅拌均匀后，放置于37℃培养箱内培养48h，间隔进行搅拌，最终芽孢活菌数可达2×10⁹cfu/g。

实施例4枯草芽孢杆菌的固态发酵培养

本实施例所用到的蓝藻固体培养基：蓝藻泥(含水率93％)53份、47份麸皮混合均匀，分装到三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到含水率为50％的蓝藻培养基。

将实施例1得到的枯草芽孢杆菌种子液，按体积质量比1％接种到蓝藻培养基上，搅拌均匀后，放置于37℃培养箱内培养48h，间隔进行搅拌，最终芽孢活菌数可达2.3×10¹⁰cfu/g。

对发酵产物中的营养成分进行检测，其中游离氨基酸总量达1002mg/100g，水解氨基酸总量达17.31g/100g。

实施例5地衣芽孢杆菌的固态发酵培养

本实施例所用到的蓝藻固体培养基：蓝藻泥(含水率93％)53份、47份麸皮混合均匀，分装到三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到含水率为50％的蓝藻培养基。

将实施例1得到的地衣芽孢杆菌种子液，按体积质量比1％接种到蓝藻培养基上，搅拌均匀后，放置于37℃培养箱内培养48h，间隔进行搅拌，最终芽孢活菌数可达2.8×10¹⁰cfu/g。

对发酵产物进行凯氏定氮，结果显示：蛋白质从发酵0h的18.8％到发酵48h的25％，增加了33％。

对发酵产物中的营养成分进行检测，其中游离氨基酸总量达1450mg/100g，水解氨基酸总量达14.47g/100g。

实施例6地衣芽孢杆菌的固态发酵培养

本实施例所用到的蓝藻固体培养基：蓝藻泥(含水率93％)63份、37份麸皮混合均匀，分装到三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，得到含水率为60％的蓝藻培养基。

将实施例1得到的地衣芽孢杆菌种子液，按体积质量比1％接种到蓝藻培养基上，搅拌均匀后，放置于37℃培养箱内培养，间隔进行搅拌，发酵48h芽孢活菌数可达3×10¹⁰cfu/g。

对发酵产物进行凯氏定氮，结果显示：蛋白质从发酵0h的20％到发酵48h的26％，增加了30％。

对发酵产物中的营养成分进行检测，其中游离氨基酸总量达2153mg/100g，水解氨基酸总量达15.16g/100g。

对发酵过程的藻毒素含量进行检测，结果如图1～6所示，藻毒素的特征物质在hplc的保留时间分别为3.30min、4.47min、5.05min，发酵0h，即接种种子液后测定藻毒素含量，结果显示，检测到保留时间3.38min和5.03min的藻毒素特征物质；发酵24h和48h，仅检测到保留时间为5.03min的藻毒素特征物质，发酵60h时，没有藻毒素特征物质检出，可见发酵60h后藻毒素被完全降解。

对比例1：

具体实施方式同实施例5，区别在于，蓝藻泥培养基的含水量调整为30％。结果显示地衣芽孢杆菌活菌数可达7.7×10⁹cfu/g，活菌量相对减少。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。