可同时识别克百威及其代谢物的抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种双特异性抗体及其制备方法和应用，尤其涉及可同时识别克百威及其代谢物的抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

克百威是一种高效、广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂和杀线虫剂。1963年由美国创制，1967年推广应用。纯品为白色结晶，25℃时水中溶解度为700ppm，在中性和酸性条件下较稳定，在碱性介质中不稳定，水解速度随ph值和温度的升高而加快。克百威具有内吸、触杀、胃毒作用，并有一定的杀卵作用，持效期较长，一般在土壤中半衰期为30～60d。可用于防治水稻螟虫、稻蓟马、稻纵卷叶虫、稻飞虱、稻叶蝉、稻象甲、玉米螟、玉米切根虫、棉蚜、棉铃虫、大豆蚜、大豆食心虫、螨类及线虫等。

但是克百威及其代谢产物3-羟基克百威在食品或环境中残留对人类生命健康造成严重的威胁。大多数检测方法集中于克百威的检测，容易忽略其代谢产物3-羟基克百威的检测，因此，寻找一种双特异性克百威和3-羟基克百威抗体及其制备方法迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种双特异性抗体，以及采用该双特异性抗体制备得到的试纸条和酶联免疫试剂盒，能够同时检测克百威和其代谢物3-羟基克百威在样品中的残留，具有高灵敏度、高特异性的特点，检测过程方便快捷，操作简便，可适用于田间大范围筛选和检测。

本发明的第一个方面是提供一种可同时识别克百威和3-羟基克百威的抗体，由下述分子结构式所示的抗原免疫动物制备得到：

本发明的第二个方面是提供一种双特异性克百威和3-羟基克百威检测试纸条，其含有本发明第一个方面所述的双特异性抗体。

本发明的第三个方面是提供一种双特异性克百威和3-羟基克百威酶联免疫试剂盒，其含有本发明第一个方面所述的双特异性抗体，利用该双特异性抗体与抗原反应，检测克百威和3-羟基克百威。试剂盒可以参考现有的酶联免疫试剂盒进行设计。

本发明的第四个方面是提供一种可用于本发明第一个方面所述的双特异性抗体的抗原，其分子结构式为式(1)所示，由式(2)所示半抗原与载体蛋白偶联得到：

本发明的第五个方面是提供一种可用于制备本发明第四个方面所述的抗原的半抗原，其特征在于，其分子结构式为式(2)所示：

本发明的第六个方面是提供一种如本发明第五个方面所述的半抗原的制备方法：取3-羟基克百威，加入二氯甲烷溶解，加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶，室温反应完全，纯化，得到权利要求1所述的克百威半抗原，其中，3-羟基克百威、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量比为：23.7mg︰10-50mg︰12.2-122mg。

优选地，3-羟基克百威、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量比为：23.7mg︰35mg︰25mg。

本发明的第七个方面是提供一种制备如本发明第四个方面所述的抗原的制备方法，包括以下步骤：

步骤a，取本发明第五个方面所述的半抗原，加入无水二甲基甲酰胺(dmf)混匀后，加入二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温反应过夜，其中，半抗原、二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的用量比为：0.10mmol︰0.10-0.20mmol︰0.10-0.20mmol；

步骤b，离心，取溶液，将溶液缓慢加入载体蛋白溶液中，所用载体蛋白的量按照半抗原与载体蛋白的摩尔比15-40︰1计；

步骤c，反应完全后，透析，得到抗原。

优选地，上述步骤a中，半抗原、二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的用量比为：0.10mmol︰0.20mmol︰0.10mmol。

本发明的第八个方面是提供本发明第一个方面所述的双特异性抗体、或本发明第二个方面所述的双特异性克百威和3-羟基克百威检测试纸条、或本发明第三个方面所述的双特异性克百威和3-羟基克百威酶联免疫试剂盒在检测样品中克百威和/或3-羟基克百威残留的应用。

本发明提供的双特异性抗体能够同时识别克百威和3-羟基克百威，采用该双特异性抗体制成试纸条和酶联免疫试剂盒，能够同时检测克百威和3-羟基克百威在样品中的残留，具有高灵敏度、高特异性的特点，检测过程方便快捷，操作简便，可适用于田间大范围筛选和检测。

附图说明

图1为克百威半抗原合成路线图。

图2为克百威elisa标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1：克百威半抗原的合成

取3-羟基克百威23.7mg，加入二氯甲烷溶解，加入丁二酸酐35mg、4-二甲氨基吡啶25mg，室温搅拌反应，同时用薄层色谱法(tlc)跟踪原料反应，直至tlc分析底物无3-羟基克百威，反应完全，所需时间大约24h。然后利用硅胶柱进行柱层析纯化(流动相为二氯甲烷︰甲醇＝9︰1)，将分离收集好的样品旋干，干燥后得到抗原产量为28.6mg，得率约为85％。

质谱和核磁共振氢谱测定结果如下，说明克百威半抗原合成成功：

lc/ms(m+h:338.2)

¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.20(d,j＝7.5hz,1h),7.10(d,j＝8.0hz,1h),6.87(t,j＝7.8hz,1h),5.95(s,1h),5.08(d,j＝4.3hz,1h),3.71(s,1h),2.89(d,j＝4.9hz,3h),2.75–2.55(m,2h),1.48(s,3h),1.43(s,3h).

实施例2：克百威抗原制备

向0.09mmol实施例1中制得的半抗原中加入0.6ml的无水dmf，混匀后，加入0.1mmol的dcc和0.1mmol的nhs活化半抗原上的羧基基团，搅拌反应过夜后，离心去沉淀，将溶液平均分为3份，分别逐滴加入到不同的载体蛋白溶液中，所述载体蛋白为bsa，ova，klh等，所述溶解蛋白的缓冲液为碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，所用蛋白的量按照半抗原与蛋白的摩尔比15-40︰1计算。待羧基活化的半抗原与蛋白分子上的氨基偶联反应过夜后，将反应液转移到半透膜中，使用10mm的ph7.2的pbs缓冲液于4℃透析3-5天，得到包被原，利用紫外分光光度计全波长扫描，偶联率约为15-20，半抗原与载体蛋白偶联成功。

实施例3：抗体的制备

动物免疫：将免疫原(半抗原与klh或bsa等的偶联物)与佐剂1:1乳化后注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为100-150μg/只，使其产生多克隆抗体。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按(8-10)∶1比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射链霉素的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

实施例4：单克隆抗体效价的测定

用间接竞争elisa法测定抗体的效价为1:150000～200000。

间接竞争elisa(icelisa)方法：用克百威半抗原-ova偶联物包被酶标板，加入克百威标准品溶液和单克隆抗体工作液，37℃反应30min，倒出孔内液体，用pbst洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入羊抗鼠酶标二抗，轻轻振荡混匀，37℃反应30min，倒出孔内液体，用pbst洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，37℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

实施例5：单克隆抗体的特异性

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将克百威、3-羟基克百威、呋喃酚、丁硫克百威、丙硫克百威、恶虫威、甲萘威做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争elisa，制作标准曲线，分析得到ic50，然后按下式计算交叉反应，结果见表1。

交叉反应率(％)＝(引起50％抑制的克百威浓度/引起50％抑制的克百威类似物浓度)x100％

表1为单克隆抗体交叉反应

结果显示各类似物的交叉反应率为：克百威100％、3-羟基克百威110.1％、呋喃酚<0.1％、丁硫克百威<0.1％、丙硫克百威<0.1％、恶虫威<0.1％、甲萘威<0.1％。本发明抗体可以同时检测克百威和3-羟基克百威。

实施例6

将1mg/ml的克百威半抗原-ova偶联物作为包被原使用碳酸盐缓冲液稀释合适的倍数后，加入到96孔酶标板中于37℃包被3小时，将克百威、3-羟基克百威标准品使用样品稀释液(pbs中含有0.1％的吐温20和明胶)稀释后，每孔加入50ul，以样品稀释液作为非抑制孔对照，随后加入经过样品稀释液稀释合适倍数的抗体，于37℃温浴30min后，洗脱，再加入羊抗鼠酶标二抗反应30min，洗脱酶标二抗后，加入含有opd或tmb的底物缓冲液显色5-10min，于酶标仪检测od值。

本发明以克百威半抗原-ova偶联物作为包被原，克百威半抗原-klh偶联物作为免疫原所获得的抗体，所建立的elisa标准曲线如图2所示，克百威抑制中浓度为0.76ng/ml，3-羟基克百威抑制终浓度为0.69ng/ml。检测限：克百威(0.03ng/ml)，3-羟基克百威(0.01ng/ml)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。