猪塞内卡病毒GD-SVA-2018株及其应用的制作方法

本发明涉及兽医生物学技术领域，更具体地，涉及一株猪塞内卡病毒gd-sva-2018株及其应用。

背景技术：

猪塞内卡病毒(senecavirusa，sva)也称为塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)，是单股正链rna病毒，属于小rna病毒科，是塞内卡病毒属的唯一成员。猪塞内卡病毒感染具体症状表现为病猪鼻吻部、蹄冠部出现水疱，同时病猪伴有厌食、跛行、发烧、嗜睡等症状。新生仔猪感染sva与成年猪不同，某些仔猪被报道患有腹泻(许多病毒均能引起临床症状)，而不引起鼻和蹄出现病变。在2002年，美国一家公司的科研人员在胚胎视网膜细胞(per.c6)培养腺病毒室发现存在未知病原体污染，经病原分离鉴定得到并命名该病原体为svv-001。svv-001最初被用来研究主要集中于其抗神经内分泌源性肿瘤的作用，研究人员将其应用于治疗不同类型的肿瘤。直到2007年和2012年加拿大和美国相继发生的猪原发性水疱病(pivd)的致病病原都被诊断为sva。在2014年后，巴西和美国相继出现几次严重的感染症状，并导致巨大经济损失，该病才逐渐被重视。2015年，中国首次从广东pivd猪场爆发的样本中检测出sva，感染母猪起泡的临床症状和感染仔猪的急性死亡。近年来，sva病例爆发性增加，虽然sva不像口蹄疫一样属于一类动物疫病，但我们对sva的研究还不够彻底，sva对猪存在潜在的威胁。我们需要对sva病毒的感染机制和遗传进化分析进行更深入的研究。同时，有必要制定预防sva病毒感染的措施。

另一方面，疫苗是预防病毒的最有效措施，其中灭活疫苗在传染病的预防中发挥着重要作用。但是目前还未见有效的塞内卡病毒疫苗可以使用，也没有其他有效的治疗手段，因此迫切需要一种可用于防治猪塞内卡病毒病的疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足和缺陷，提供一种猪塞内卡病毒gd-sva-2018株

本发明的另一目的在于提供所述猪塞内卡病毒gd-sva-2018株在制备猪塞内卡病毒灭活疫苗中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

猪塞内卡病毒gd-sva-2018株，所述病毒株的全基因序列如seqidno：2所示，为7220bp。

本发明采用pcr方法对广东地区采集的疑似sva病料进行pcr检测，经pcr证实为猪塞内卡病毒(sva)，采用仓鼠肾细胞(bhk-21)细胞分离培养，分离培养出1株bhk-21传代细胞培养适应毒株，命名为gd-sva-2018株。

本发明通过观察细胞病变、生物学特性研究等途径证实分离的病毒为猪塞内卡病毒后设计扩增gd-sva-2018株全部结构基因序列的9对引物，通过重叠pcr测序得出gd-sva-2018中间序列，两端序列则通过经过pcr扩增，胶回收，加polya，连接t载体，转化，提取质粒等过程，送公司测序，最后通过生物学软件拼接得到gd-sva-2018株全部结构基因序列。

本发明还提供所述猪塞内卡病毒gd-sva-2018株的繁殖方法，包括如下步骤：

当bhk-21细胞长至90％左右时，弃去培养液，用pbs清洗3次后，加少量dmem，然后按1％的接毒量接种gd-sva-2018株于bhk-21细胞，轻轻摇动，使病毒液充分均匀的分布于培养液中，置于5％co2、37℃温箱中孵育1h后，补加培养液，使血清的终浓度为2％，设空白对照组。逐日观察细胞病变情况，当细胞病变达80％左右时，约在接毒后的24～36h左右，反复冻融三次，收获病毒，放于-80℃备用。

本发明还请求保护所述猪塞内卡病毒gd-sva-2018株在制备猪塞内卡病毒灭活疫苗中的应用；具体为将猪塞内卡病毒gd-sva-2018株灭活病毒液与油乳剂混合制成灭活疫苗。

优选地，所述油乳剂为白油乳剂201。

将上述灭活疫苗对2月龄左右健康母猪，在免疫后每七天采血，两周后再次免疫。检测到sva抗体效价达1:256以上，几何平均为1:512，而对照母猪塞内卡病毒抗体显示阴性；说明以广东分离株gd-sva-2018株制备的灭活疫苗接种母猪后具有良好的免疫原性。

在疫苗制备中，对病原进行有效的灭活，可提供安全的疫苗，主要通过将猪塞内卡病毒体外培养后灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。

优选地，所述灭活剂为β-丙内酯。

本发明采用1:2000和1:4000的β丙内酯两次灭活猪塞内卡病毒gd-sva-2018株，每次灭活4h，两次灭活后，放置37℃恒温箱水解2h。将灭活的病毒液接种bhk-21细胞经盲传3代无cpe。所以最终确定1:2000和1:4000的β丙内酯用来灭活猪塞内卡病毒。

一种猪塞内卡病毒灭活疫苗，包含gd-sva-2018株灭活病毒液与油乳剂。

优选地，所述gd-sva-2018株灭活病毒液与油乳剂的体积比为1:1。

优选地，所述猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备方法为先将油乳剂低速搅拌，过程中逐渐加入灭活完全的gd-sva-2018株灭活病毒液，然后高速搅拌混合液进行乳化，即得猪塞内卡病毒灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种猪塞内卡病毒gd-sva-2018株，所述病毒株的全基因序列如seqidno：2所示，为7220bp。通过将猪塞内卡病毒gd-sva-2018株灭活病毒液与油乳剂201混合制成灭活疫苗，所述疫苗免疫2月龄母猪28d后，采血测中和抗体效价可达1:256以上，几何平均为1:256～1:512之间，具有良好的免疫原性，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明gd-sva-2018株senecavirusa保守区域的扩增电泳图。

图2为本发明gd-sva-2018株接种于bhk-21单层细胞后的细胞形态。

图3为本发明gd-sva-2018株9段重叠片段长度扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为本发明gd-sva-2018株9段重叠片段长度扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明gd-sva-2018株vp1基因核苷酸序列与来自genbank中的75株vp1基因核苷酸序列的同源性比较结果。

图6为本发明gd-sva-2018株vp1基因序列与来自genbank中的75株vp1基因核苷酸序列生成的svavp1基因基因系统进化树。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1猪塞内卡病毒毒株gd-sva-2018株的分离鉴定和生物学特性的研究

1、材料

(1)病料和细胞

组织病料采集于广东省某猪场病死猪的水疱液、水疱皮。细胞：本研究采用bhk-21细胞，本实验室冻存，细胞状态良好。

(2)试剂及配方

细胞培养液：dmem(gibco)营养液+10％fbs+1％双抗。

细胞维持液：dmem+2％fbs。

细胞消化液：0.25％胰酶，ph＝8～9。

pbs缓冲液：称取kh2po40.2g，12水合na2hpo42.83g，nacl8g和kcl0.2g，加ddh2o定容至1000ml，调ph至7.2，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，灭菌后4℃保存。

hanks液：nacl8g，kcl0.4g，12水合na2hpo40.06g，葡萄糖1g和酚红粉0.02g，加ddh2o定容至1000ml，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤，灭菌后4℃保存。

0.01m磷酸盐缓冲液(pbs)：8gnacl，0.2gkc1，1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800m1蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可。保存于室温或4℃冰箱。

2、引物设计

从ncbi上获取senecavirusa全基因序列15条，经过maga7.0生物信息学软件分析比对得到全基因序列的保守序列区域。根据引物设计原则利用primerprimer6.0设计senecavirusa保守区域的特异性引物：

svvf：5'-cctcagagacacagaactc-3'

svvr：5-'gaaagggtgatcgggaag-3'

3、病料处理和pcr检测

(1)病料处理

取部分水泡皮用液氮研磨至粉末状，然后用200μl含1％抗生素的dmem将其重悬放置-80℃保存，再取200μl的pbs将研磨里的粉末残渣重悬用来提取基因组。将含有水泡液的棉签剪段放置1.5ml的离心管中，往离心管中加入500μl含1％抗生素的dmem，将离心管放置振荡仪剧烈振荡30s。分别将病料研磨液和水泡稀释液放置-80℃三冻三融。将冻融好的病料研磨液和水泡液稀释液用4℃离心机12000r/min离心十分钟取上清。把离心取得的上清用0.22μm滤器过滤并储存在-80℃超低温冰箱。

(2)pcr检测

采用病毒rna提取试剂盒提取并反转录成cdna。以反转录所得的cdna为模板，以ddh2o为阴性对照，加入下列组分，配成20μl体系，进行pcr反应。反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃30s，30个循环；72℃10min。pcr反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用1xtae缓冲液配制1.0％琼脂糖悬液，微波炉加热溶解后冷却50℃，加入6μlgodview混匀，再将其倒入准备好的凝胶板中。待胶凝固后，在加样孔分别加入pcr产物样品及阴性对照及标准的dnamarkerdl2000样品，120v电压电泳30min左右后，在紫外检测仪下观察电泳结果并照相。

结果：从疑似sva感染的组织病料中提取rna，进行pcr扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测表明，获得约442bp的特异性条带(图1)，与预期片段大小相等。序列如seqidno：1所示，证实为猪塞内卡病毒(sva)。

4、病毒的培养

pcr检测阳性的病料，按照维持液量的10％接种于长至约90％的bhk-21细胞，置37℃，5％co2培养箱中培养，细胞病变达约90％，反复冻融三次，收获病毒。若没有病变，盲传直至出现稳定的细胞病变，此后按培养液的1％接毒，将该毒株连续传代直至达到稳定的效价，培养出1株bhk-21传代细胞培养适应毒株，命名为gd-sva-2018株。

5、细胞病变观察

将形态良好，长至80％～90％的bhk-21单层细胞，弃培养液，将病毒按照维持液量的1％接种于bhk-21细胞，置37℃，5％co2恒温培养箱观察，一般接毒后4h后细胞出现病变。

结果：将处理后的组织病料接种于长至80％的bhk-21传代细胞，正常bhk-21细胞紧密的贴壁生长，接毒后的细胞内颗粒物质增多，接着细胞变圆，皱缩，呈网状，视野中有空洞，很多细胞发生裂解、破碎，部分细胞拉长的碎片仍贴在细胞瓶壁上(图2)。

6、病毒tcid50的测定

准备好形态良好，长至80％～90％的bhk-21单层细胞的96孔板。用无血清dmem培养基将sva病毒作连续10倍稀释，即从10^-1，i0^-2，10^-3......10^-8。将稀释好的病毒液直接加入铺好bhk-21细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，每孔接种100μl，设正常细胞对照。混匀后再培养36h左右后，在显微镜下观察细胞病变(cpe)，判定cpe孔数，根据reed-muench法计算病毒tcid50。

结果：gd-sva-2018株，经过bhk-21细胞增殖，tcid50稳定在10⁸/ml左右。

7、耐氯仿实验鉴定

取5支灭菌的离心管，在超净台内加入1mlgd-sva-2018株细胞培养液。3管加入终浓度为4.8％的分析纯氯仿，振荡混匀，置4℃，作用10min，随后，4000rpm离心8min，然后取上清备用。剩下两管做阴性对照。将上清接种于形态良好，长至80％～90％的bhk-21单层细胞并连续传至三代。病毒可使细胞产生cpe，并且pcr检测sva阳性作为判断结果的方式。

实施例2猪塞内卡病毒毒株gd-sva-2018的全基因组克隆与序列分析

1、材料

猪塞内卡病毒毒株gd-sva-2018，genestar2xtaq酶，pcr仪，tae溶液琼脂糖，eb替代物，t载体，提病毒rna试剂盒。

2、引物设计

从gebank下载公布的sva基因序列，设计9对相互重叠片段的引物(表1)，用于扩增包括全部编码区在内的全基因序列。引物有上海生工生物工程有限公司合成。

表1扩增sva全基因的引物

3、病毒rna的提取和全基因扩增

用病毒rna提取试剂盒提取病毒rna。用反转录试剂盒将病毒rna反转为cdna,以cdna为模板进行pcr扩增。

扩增体系：1μlcdna，各1μl上下游引物，10μlgenestar2xtaq酶，7μlddh2o，共20μl体系。

反应过程：预变性94℃，2min；变性94℃，15s，退火51～59℃(表2)，30s，延伸72℃，30～60s，30～35个循环；终延伸72℃，5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶(含6μl/100mleb替代物)电泳检测。

若pcr产物为阳性，将cxsvv1f/1r～cxsvv7f/7r扩增的pcr产物进行胶回收后送至上海生物股份有限公司测序。cxsvv0f/0r与cxsvv8f/8rpcr产物回收纯化后与t载体连接，经转化、提取质粒等过程，将质粒送至上海生工生物股份有限公司测序。

结果：对猪塞内卡病毒gd-sva-2018各片段进行扩增，9段重叠片段长度扩增产物经琼脂糖凝胶电泳测序结果如图3和图4所示，扩增产物大小与预期大小一致。

4、sva全基因组序列的测定与分析

将由上海生工生物有限公司成功测序后的9段序列拼接得到gd-sva-2018全基因序列。用dnastar软件将gd-sva-2018全基因序列与genbank上已发表的sva序列进行比较和分析。所选用毒株均为genbank上收录的sva毒株(表2)。

表2所用毒株的登录号

结果：用dnastar软件将9段重叠片段的测序结果进行拼接，得到猪塞内卡病毒gd-sva-2018全基因序列。拼接结果表明，该猪塞内卡病毒分离株的全基因序列为7220bp，序列如seqidno：2所示。

利用dnastar序列分析软件对gd-sva-2018株的vp1基因核苷酸序列分别与来自genbank中的75株vp1基因核苷酸序列进行同源性比较，如图5。由图可知，gd-sva-2018株的vp1基因序列与其他sva毒株的vp1基因序列同源性90.7％～99％之间；gd-sva-2018-vp1基因序列与中国gd03/2017和gd01/2017毒株序列同源性最高为99.0％，与svv-001株的vp1基因序列的同源性最低。

利用beauti/beast序列分析软件对gd-sva-2018株的vp1基因序列及来自genbank中的75株vp1基因核苷酸序列进行遗传进化分析，并分别生成svavp1基因基因系统进化树(如图6)。由图可知，gd-sva-2018株由美国svausa/gbi26/2015和usa/gbi29/2015演变而来，与svv-001株的关系最远。

实施例3猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备及免疫效力检测

一、材料

bhk-21细胞，保存于华南农业大学微生物实验室；gd-sva-2018株：通过实施例1和2获取，并保藏于实验室。

二月龄的猪塞内卡病毒抗体阴性的母猪：广州良种猪场。

灭活剂：β-丙内酯

乳化剂：白油佐剂201。

二、猪塞内卡病毒灭活疫苗制备方法

1、病毒增殖

将病毒液，按照维持液的1％接种于长至90％左右bhk-21细胞，置37℃，5％co2培养箱中培养，细胞病变达约90％(24～36h)收毒，反复冻融三次，-80℃保存备用。

2、病毒tcid50c测定

准备好形态良好，长至80％～90％的bhk-21单层细胞的96孔板。用无血清dmem培养基将sva病毒作连续10倍稀释，即从10^-1，10^-2，10^-3......10^-8。将稀释好的病毒液直接加入铺好bhk-21细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度作8个重复，每孔接种100μl，设正常细胞对照。混匀后再培养36h左右后，在显微镜下观察细胞病变(cpe)，判定cpe孔数，根据reed-muench法计算病毒tcid50。

结果显示，gd-sva-2018株在bhk-21细胞上稳定增殖在10^8.3tcid50。

3、病毒灭活及灭活检验

(1)灭活时间的确定

病毒液中加入终浓度为1:2000的β-丙内酯，混匀，4℃进行灭活期间，每隔2小时摇动病毒悬液一次。分别于4h、8h、12h取出病毒液进行水解，然后进行灭活检验，同时设阳性对照。

病毒灭活效果检验：将不同时间段取出的病毒液分别种bhk-21细胞上，连续盲传三代，期间观察细胞cpe情况；盲传三代后将细胞反复冻存3次，通过pcr检测培养液的抗原活性，判断灭活效果。

结果显示，灭活4h、8h、12h灭活的病毒在bhk-21细胞上均没有产生细胞病变，且细胞生长情况良好。因此选择，4h作为灭活时间。

(2)灭活程序及检验

用1:2000β-丙内酯灭活病毒灭活4h，然后用1:4000β-丙内酯灭活病毒灭活4h，然后将灭活好的病毒放置37℃恒温箱水解2h，然后在bhk-21细胞上盲传3代，同时观察细胞病变情况。

将灭活的病毒液接种bhk-21细胞经盲传3代无cpe，所以最终确定1:2000和1:4000的β丙内酯用来灭活猪塞内卡病毒。

4、乳化：

gd-sva-2018株灭活疫苗的制备

油相：高压好的佐剂201

水相：首先将灭活好的gd-sva-2018株病毒液放置37℃水解2h，再将已经水解完的病毒液进行灭活检测，取20ml灭活完全的病毒液。

乳化(20ml)：水相：油相＝1：1，即10ml高压好的佐剂201，10ml灭活完全的gd-sva-2018株病毒液。取佐剂201放置50ml离心管中，在乳化机低速搅拌的过程中逐渐加入灭活完全的病毒液10ml，然后高速搅拌混合液进行乳化。高速搅拌5min钟后，进行乳化检验。检验合格后，将制备好的疫苗放置4℃冰箱保存。

三、疫苗效力检验

1、母猪免疫试验

将11只2月龄母猪分为疫苗注射组、阴性对照组二组，疫苗注射组、阴性对照组每组5只。注射组每只注射3ml猪塞内卡病毒乳化剂；阴性对照组每只母猪注射pbs3ml；免疫后每隔一周进行采血分离血清。将分离的血清用来做病毒中和实验。

结果显示，制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗免疫母猪后，观察30d，母猪均健康生长，无不良反应。

2、抗体水平检测

(1)血液处理：37℃，静置1h，8000rpm，离心10min，取血清分装，-20℃保存备用。

(2)固定病毒的稀释：通过观察cpe的方法得出gd-sva-2018的tcid50，将准备好已知tcid50的gd-sva-2018稀释到100tcid50/0.1ml。

3、病毒中和实验

免疫后一周到免疫后四周每七天采取血液并分离过滤得到无菌的血清；然后将采取的血清用60℃金属水浴锅灭活30min，取200μl不同浓度的稀释血清分别与200μl标准病毒(100tcid50/0.1ml)混合，置37℃恒温箱作用1h；取混合液0.1ml分别加到细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，每一稀释度接种4孔细胞。同时设4孔正常细胞对照和设4孔100tcid50/0.1ml作病毒对照；设病毒滴度对照。将病毒液连续10倍稀释后，加到细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，每个稀释度接种4孔细胞，每孔加0.1ml。结果判定，阴性对照组血清和阳性病毒对照组细胞均病变。以能中和50％以上的血清稀释效价作为免疫效力评估的数据。

猪塞内卡病毒疫苗中和抗体效价测定结果如表3所示，后备母猪在注射猪塞内卡病毒灭活疫苗后28d，病毒中和试验方法检测抗体效价结果：试验组(乳化剂注射组)的抗体效价平均约为1:256～1:512之间。阴性对照组(0ml组)的猪的猪塞内卡病毒抗体水平呈阴性(<＝1：5)。本发明中的猪免疫实验表明，实验室制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体。

表3猪塞内卡病毒疫苗中和抗体效价测定结果结果

序列表

<110>华南农业大学

<120>猪塞内卡病毒gd-sva-2018株及其应用

<141>2019-03-27

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>415

<212>dna

<213>猪塞内卡病毒(senecavirusa)

<400>1

tttcctttcggtcgactgagcaggacagcaacgtagggcacgtaagcgtctgaggcaggc60

tcgggttcagacacccgcccaaacgccataagagtgggtatacgggccagttgtaagagg120

tcggttatttcaccggggaggtaattgacgggaggggtacgcacattcccgtaagcaggg180

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<210>2

<211>7222

<212>dna

<213>猪塞内卡病毒(senecavirusa)

<400>2

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