本发明涉及药物化学技术领域，涉及一种肽的合成方法，更具体的说是涉及一种特立帕肽的合成方法。
背景技术：
骨质疏松症作为一种进行性的代谢性骨病变，可导致患者尤其是老年患者发生骨折，从而严重影响患者的生活质量，甚至威胁患者的生命。现有的药物治疗可降低患者发生骨折的风险，减少骨量的丢失，但是不能重建受损的骨的微观结构。因此，尽管使用了现有的治疗药物，但仍有很多患者会发生骨折，或发生骨折的风险仍比较高。人们迫切需要有新的、能够改善骨结构的骨质疏松症治疗药物，其目标是进一步降低骨折风险。
特立帕肽，英文名称为teriparatide，其肽序为：
h-ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-his-asn-phe-oh，商品名forteo，是美国礼来公司开发的一种合成的多肽激素，其为人甲状旁腺素(pth)的1-34氨基酸片段，该片段是含有84个氨基酸的内源性pth的具有生物活性的n-末端区域。
pth由甲状旁腺分泌，是血钙浓度的一个重要调节因子。血钙浓度下降可刺激pth的合成与分泌。pth有3个作用：增加骨钙的释放；减少从肾脏清除的钙量；刺激产生可增加钙吸收的1，25-二羟基维生素d3(1，25(oh)2d3)。虽然pth的一个主要作用是刺激破骨细胞吸收骨质，但是有研究提供了令人信服的证据：成骨细胞系的骨原细胞是pth的一个主要作用靶位。pth间断用药可增加成骨细胞的数量，增加骨的形成。
目前的常规骨质疏松药物一般只通过作用于破骨细胞来减缓或阻断骨质流失，而特立帕肽这种甲状旁腺激素的衍生物有增加成骨细胞数目、增强其活性及阻止成骨细胞凋亡的作用。因其可增加成骨细胞的活性及数量，从而可以促进骨生长，用于严重骨质疏松的治疗。
特立帕肽刺激骨形成和骨吸收，可减少绝经后妇女骨折的发生率，根据给药方式的不同，还能提高或降低骨密度。连续输注可导致甲状旁腺素pth浓度持续增高，因此比仅引起血清甲状旁腺素pth浓度短暂增高的每日注射法产生的骨吸收作用更强。此外，本药不抑制二磷酸腺苷诱导途径或者胶原诱导途径的血小板聚集反应。
目前一种比较流行的合成特立帕肽的方法是固相逐步合成(spps)法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是因为特立帕肽由34个氨基酸组成，固相逐步合成法的产品收率低，肽段容易卷曲，反应位点不易暴露，而且产品纯化困难，不易得到高纯度的特立帕肽。该方法价格成本高，步骤较繁琐，总体收率不高。
因此，如何提供一种操作简单且收率和纯度较高的特立帕肽的合成方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种特立帕肽的合成方法，该方法操作简单、总收率高、纯度高、成本低等特点，利于工业化生产。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种特立帕肽的合成方法，包括以下步骤：
(1)在活化试剂和偶联试剂的作用下，将树脂固相载体和fmoc-phe-oh偶联得到fmoc-phe-树脂；
(2)在活化试剂和缩合试剂的作用下，依照特立帕肽的氨基酸序列，从碳端开始使fmoc-phe-固相载体先偶联17位丝氨酸，得到肽树脂a；
(3)将步骤(2)得到的肽树脂a中17位丝氨酸的游离羟基与fmoc-asn(trt)-oh进行酯缩合，并脱除fmoc保护基团，得到肽树脂b；
(4)然后再按照特立帕肽主链肽序，将步骤(3)中得到的肽树脂b依次偶联其他具有n端fmoc保护且侧链保护的氨基酸，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，最终获得特立帕肽树脂，经过裂解试剂裂解得到特立帕肽粗肽；
(5)将步骤(4)中得到的特立帕肽粗肽进行分离纯化，冻干，得到特立帕肽纯品。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的特立帕肽采用了新的合成方式，区别于常规的顺序偶联，从特立帕肽的碳端开始偶联，解决了固相逐步合成法产品收率低，肽段容易卷曲，反应位点不易暴露，而且产品纯化困难，不易得到高纯度特立帕肽的技术问题；
2、本发明的原料如活化试剂、偶联试剂、缩合试剂和裂解试剂等所用试剂简单易得，价格低廉，且有利于环保，降低了合成成本；
3、本发明特立帕肽的合成方法与现有技术相比，具有思路新颖、操作简单、总收率高、纯度高、成本低等特点，利于工业化生产。
进一步，步骤(1)中，活化试剂为1-羟基苯并三唑(hobt)或n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(hoat)；偶联试剂为n，n-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶组成的双体系偶联试剂(dic/dmap)。
优选地，上述活化试剂与树脂固相载体的摩尔比为1-6∶1，上述偶联试剂与树脂固相载体的摩尔比为1-5∶1。
采用上述进一步的有益效果在于，上述活化剂能够增强树脂固相载体表面对fmoc-phe-oh的吸附能力，有利于fmoc-phe-树脂的偶联；上述偶联试剂可降低合成fmoc-phe-树脂熔体的粘度，改善体系的分散度以提高加工性能，进而使制品获得良好的表面质量及机械、热和电性能。
进一步，步骤(1)中，树脂固相载体为wang树脂或2c1-ctc树脂，树脂固相载体的替代度为0.3-0.8mmol/g。
优选地，上述fmoc-phe-oh和树脂固相载体的摩尔比为3-8∶1，更优选为4.5-5.5∶1。
采用上述进一步的有益效果在于，本发明树脂固相载体选用替代度为0.3-0.8mmol/g的wang树脂或2c1-ctc树脂，在保证特立帕肽纯度的前提下提高了其总收率。
进一步，步骤(1)中，fmoc-phe-树脂的替代度为0.12-0.30mmol/g。
进一步，步骤(2)中，活化试剂为1-羟基苯并三唑(hobt)或n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(hoat)；缩合试剂为n，n-二异丙基碳二亚胺(dic)或n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)。
优选地，上述活化试剂与fmoc-phe-固相载体的摩尔比为1-6∶1，上述缩合试剂与fmoc-phe-固相载体的摩尔比为1-5∶1。
采用上述进一步的有益效果在于，上述缩合试剂用于保护氨基酸不被破坏，并提高产率，减少副反应的生成。
进一步，步骤(2)中，偶联上述17位丝氨酸采用的原料为boc-ser-oh，按顺序依次偶联的保护氨基酸为fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh和boc-ser-oh。
进一步，步骤(3)中，上述fmoc-asn(trt)-oh和肽树脂a的摩尔比为5-10∶1。
进一步，步骤(3)中，上述酯缩合反应的温度为20-50℃，反应的时间为2-5h；上述脱fmoc反应的温度为15-30℃，反应的时间为10-30min。
进一步，步骤(4)中，按顺序依次偶联的保护氨基酸为fmoc-leu-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh和fmoc-ser(tbu)-oh。
进一步，步骤(4)中，裂解试剂是由体积百分比为70-85％的tfa、体积百分比为10-15％的edt、余量为水组成的混合试剂。
优选地，上述裂解剂的用量为每克特立帕肽10-20ml，裂解反应的温度为20-30℃，裂解反应的时间为3-5h。
采用上述进一步的有益效果在于，裂解剂的作用为去除保护基和树脂，以得到特立帕肽粗肽。
进一步，步骤(5)中，分离纯化的具体操作步骤为：将获得的特立帕肽粗肽干燥称重后用水溶解，经c18或c8柱纯化，流动相为1％的tfa水溶液或1％的tfa乙腈溶液，流速为200-500ml/min，检测波长为214nm，用hplc跟踪收集所需要的流出液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种特立帕肽的合成方法，本发明的特立帕肽采用了新的合成方式，区别于常规的顺序偶联，从特立帕肽的碳端开始偶联，解决了固相逐步合成法产品收率低，肽段容易卷曲，反应位点不易暴露，而且产品纯化困难，不易得到高纯度特立帕肽的技术问题；合成方法操作简单、总收率高、成本低，最后合成的特立帕肽纯度高较高，利于工业化生产。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)fmoc-phe-树脂的合成：
称取替代度为0.8mmol/g的wang树脂1mol，加入固相反应柱中，用dmf溶胀树脂45分钟后，取3molfmoc-phe-oh和1molhobt加入固相反应柱中，20-25℃反应1小时；反应结束后用dmf洗涤3次，然后加入1moldic和dmap的混合液，20-25℃搅拌反应6小时；用dmf洗涤4次，dcm洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到fmoc-phe-wangresin，检测替代度为0.30mmol/g。
(2)肽树脂a的合成：
称取替代度为0.30mmol/g的fmoc-phe-wangresin1mol，加入固相反应柱中，用dmf溶胀树脂30分钟后，加入dblk在15℃下反应10分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次；取5molfmoc-asn(trt)-oh和1molhobt溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟，加入1moldic活化5分钟后加入到固相反应柱中，20℃下反应2小时，然后用dmf洗涤3次；
重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成fmoc-his(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh和boc-ser-oh的偶联；加入dblk在15℃下反应10分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤3次，得到肽树脂a；
(3)肽树脂b的合成：
取1mol肽树脂a加入固相反应柱中，取5molfmoc-asn(trt)-oh和1molhobt溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟后滴入1moldic，活化5分钟，加入固相反应柱中，20℃下反应2小时；反应结束后加入dblk在15℃下反应10分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次，得到肽树脂b；
(4)特立帕肽粗肽的合成：
取1mol肽树脂b加入固相反应柱中，将5molfmoc-leu-oh和1molhobt溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟后滴入1moldic，活化5分钟，加入固相反应柱中，20℃下反应2小时；反应结束后加入dblk在15℃下反应10分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次；重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成fmoc-his(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh和fmoc-ser(tbu)-oh的偶联，脱除fmoc保护基团后，用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到特立帕肽树脂；
将特立帕肽树脂置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的量加入裂解试剂(体积比为70％tfa、10％edt、20％水)，20℃搅拌3小时；反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩；加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即特立帕肽粗肽，纯度为85.9％；
(5)特立帕肽纯品的制备：
将获得的特立帕肽粗肽干燥称重后用水溶解，经c18柱纯化，流动相为1％的tfa水溶液，流速为200ml/min，检测波长为214nm，用hplc跟踪收集所需要的流出液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品；
经检测，特立帕肽纯品纯度：99.0％，总收率为49.2％，最大单一杂质0.10％。
实施例2
(1)fmoc-phe-树脂的合成：
称取替代度为0.5mmol/g的wang树脂1mol，加入固相反应柱中，用dmf溶胀树脂60分钟后，取8molfmoc-phe-oh和6molhoat加入固相反应柱中，20-25℃反应2小时；反应结束后用dmf洗涤3次，然后加入5moldic和dmap的混合液，20-25℃搅拌反应8小时；用dmf洗涤4次，dcm洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到fmoc-phe-wangresin，检测替代度为0.15mmol/g。
(2)肽树脂a的合成：
称取替代度为0.30mmol/g的fmoc-phe-wangresin1mol，加入固相反应柱中，用dmf溶胀树脂30分钟后，加入dblk在30℃下反应30分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次；取10molfmoc-asn(trt)-oh和6molhoat溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴30分钟，加入5moldic活化20分钟后加入到固相反应柱中，50℃反应5小时，然后用dmf洗涤3次；
重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成fmoc-his(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh和boc-ser-oh的偶联；加入dblk在30℃下反应30分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤3次，得到肽树脂a；
(3)肽树脂b的合成：
取1mol肽树脂a加入固相反应柱中，取10molfmoc-asn(trt)-oh和6molhoat溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟后滴入5moldic，活化5分钟，加入固相反应柱中，50℃反应5小时；反应结束后加入dblk在30℃下反应30分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次，得到肽树脂b；
(4)特立帕肽粗肽的合成：
取1mol肽树脂b加入固相反应柱中，将10molfmoc-leu-oh和6molhoat溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟后滴入5moldic，活化5分钟，加入固相反应柱中，50℃反应5小时；反应结束后加入dblk在30℃下反应30分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次；重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成fmoc-his(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh和fmoc-ser(tbu)-oh的偶联，脱除fmoc保护基团后，用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到特立帕肽树脂；
将特立帕肽树脂置于裂解反应器中，以20ml/g树脂的量加入裂解试剂(体积比为80％tfa、15％edt、5％水)，30℃搅拌5小时；反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤5次，合并滤液后减压浓缩；加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到白色粉末固体，即特立帕肽粗肽，纯度为86.7％；
(5)特立帕肽纯品的制备：
将获得的特立帕肽粗肽干燥称重后用水溶解，经c18柱纯化，流动相为1％的tfa乙腈溶液，流速为500ml/min，检测波长为214nm，用hplc跟踪收集所需要的流出液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品；
经检测，特立帕肽纯品纯度：99.5％，总收率为48.7％，最大单一杂质0.12％。
实施例3
(1)fmoc-phe-树脂的合成：
称取替代度为0.3mmol/g的wang树脂1mol，加入固相反应柱中，用dmf溶胀树脂50分钟后，取5molfmoc-phe-oh和4molhobt加入固相反应柱中，20-25℃反应2小时；反应结束后用dmf洗涤3次，然后加入3moldic和dmap的混合液，20-25℃搅拌反应6小时；用dmf洗涤4次，dcm洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到fmoc-phe-wangresin，检测替代度为0.12mmol/g。
(2)肽树脂a的合成：
称取替代度为o.30mmol/g的fmoc-phe-wangresin1mol，加入固相反应柱中，用dmf溶胀树脂30分钟后，加入dblk在20℃下反应20分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次；取8molfmoc-asn(trt)-oh和3molhobt溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴20分钟，加入3moldic活化10分钟后加入到固相反应柱中，30℃反应3小时，然后用dmf洗涤3次；
重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成fmoc-his(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh和boc-ser-oh的偶联；加入dblk在20℃下反应20分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤3次，得到肽树脂a；
(3)肽树脂b的合成：
取1mol肽树脂a加入固相反应柱中，取10molfmoc-asn(trt)-oh和3molhobt溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟后滴入3moldic，活化5分钟，加入固相反应柱中，30℃反应3小时；反应结束后加入dblk在20℃下反应20分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次，得到肽树脂b；
(4)特立帕肽粗肽的合成：
取1mol肽树脂b加入固相反应柱中，将8molfmoc-leu-oh和3molhobt溶于体积比为1∶1的dcm和dmf混合溶液，冰浴10分钟后滴入3moldic，活化5分钟，加入固相反应柱中，30℃反应3小时；反应结束后加入dblk在20℃下反应20分钟脱除fmoc保护，然后用dmf洗涤4次，dcm洗2次；重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次完成fmoc-his(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh和fmoc-ser(tbu)-oh的偶联，脱除fmoc保护基团后，用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到特立帕肽树脂；
将特立帕肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的量加入裂解试剂(体积比为75％tfa、15％edt、10％水)，25℃搅拌4小时；反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤4次，合并滤液后减压浓缩；加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤4次，真空干燥得到白色粉末固体，即特立帕肽粗肽，纯度为89.2％；
(5)特立帕肽纯品的制备：
将获得的特立帕肽粗肽干燥称重后用水溶解，经c8柱纯化，流动相为1％的tfa水溶液，流速为300ml/min，检测波长为214nm，用hplc跟踪收集所需要的流出液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品；
经检测，特立帕肽纯品纯度：99.6％，总收率为52.3％，最大单一杂质0.08％。
综上所述，本发明的有益效果为：采用了新的合成方式，区别于常规的顺序偶联，从特立帕肽的碳端开始偶联，解决了固相逐步合成法产品收率低，肽段容易卷曲，反应位点不易暴露，而且产品纯化困难，不易得到高纯度特立帕肽的技术问题；最终制备得到的特立帕肽纯品纯度在99％以上，总收率最高为52.3％，最大单一杂质在0.12％以下。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。