本发明属于多肽药物领域，涉及一种特立帕肽的制备方法。
背景技术：
特立帕肽，英名为：teriparatide，为一直链34肽，结构式如下：
肽序列为：
h-ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu--gln-asp-val-his-asn-phe-oh
特立帕肽forteo(teriparatide)是第一种获得美国食品及药物管理局fda批准的骨形成剂类新药，用于原发性骨质疏松及性腺功能减退性骨质疏松、绝经后骨质疏松。特立帕肽[hpth(1-34)]是一种合成的多肽激素，为人甲状旁腺素pth的1-34氨基酸片段，该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素pth具有生物活性的n-末端区域。本药的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素pth以及牛甲状旁腺素pth(bpth)完全相同。本药刺激骨形成和骨吸收，可减少绝经后妇女骨折的发生率，根据给药方式的不同，还能提高或降低骨密度。连续输注可导致甲状旁腺素pth浓度持续增高，因此比仅引起血清甲状旁腺素pth浓度短暂增高的每日注射法产生的骨吸收作用更强。
现有的合成方法，制备特立帕肽发现现有技术存在的技术问题是：合成纯度偏低、成本高，特别是杂质met8(o)-特立帕肽h和杂质d-his32-特立帕肽含量较大，不适合规模化生产的问题，因此研发出一种纯度高、成本低的特立帕肽的制备方法是本领域人员亟需解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种特立帕肽的制备方法，解决目前技术存在的缺陷和不足。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种特立帕肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在偶联试剂和活化试剂的作用下，树脂固相载体和fmoc-phe-oh偶联反应，得到fmoc-phe-树脂；
(2)按照特立帕肽氨基酸序列c端到n端的顺序，从步骤(1)得到的fmoc-phe-树脂出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂；
(3)采用含nh4i/me2s的tfa体系的裂解液，裂解3小时，将步骤(2)得到的肽树脂的肽链从肽树脂上脱下，经过初步纯化、精制即得特立帕肽。
采用上述进一步的有益效果是：本发明裂解试剂采用含nh4i/me2s体系，可将合成过程中残基met氧化副产物met(o)还原为met，提高了粗肽纯度，降低了hplc纯化难度。经hplc纯化后，杂质met8(o)-特立帕肽含量降低到0.1％以下。
进一步，步骤(1)所述偶联试剂为n，n-二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶双体系偶联试剂。
进一步，所述偶联试剂的加入量为每0.1molfmoc-phe-oh对应加入35mldic和3.2gdmap。
进一步，步骤(1)所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
进一步，步骤(1)所述树脂固相载体为hmplinkeramide树脂。
采用上述进一步的有益效果是：本发明针对现有技术中均采用王树脂或2-ctc树脂为固相载体，造成特立帕肽总收率较低的缺陷，选择hmplinker树脂作为固相载体进行特立帕肽的逐步合成，在保证特立帕肽纯度的前提下提高了其总收率。
进一步，步骤(1)所述树脂固相载体为取代值为0.6-0.65mmol/g的hmplinker树脂。
进一步，步骤(1)所述活化试剂与fmoc-phe-oh的摩尔比范围为(5-9)∶1，步骤(2)所述活化试剂与fmoc-phe-树脂的摩尔比为3∶1。
进一步，步骤(1)所述树脂固相载体与fmoc-phe-oh的摩尔比范围为(2-5)∶1。
进一步，步骤(2)所述偶联反应时间为120-180分钟。
进一步，步骤(2)所述缩合试剂为comu。
采用上述进一步的有益效果是：本发明选择comu作为缩合试剂，可有效的减少d-his32-特立帕肽的生成，提高了粗肽的收率，降低了hplc纯化难度。经过hplc纯化后，杂质d-his32-特立帕肽含量降低到0.1％以下。
进一步，步骤(2)所述缩合试剂与步骤(1)中树脂固相载体的摩尔比为(2-4)∶1。
本发明的有益效果是：本发明选择hmplinker树脂作为固相载体，选择comu作为缩合试剂，裂解试剂采用含nh4i/me2s体系，进行特立帕肽的逐步合成，在保证特立帕肽纯度的前提下提高了其总收率，经过hplc纯化后，杂质d-his32-特立帕肽含量降低到0.1％以下，杂质met8(o)-特立帕肽含量降低到0.1％以下，由本发明所述方法合成的特立帕肽经hplc检测，纯度最高大于99％，最大单一杂质小于0.1％，总收率大于50％。
具体实施方式
以下的实施例在于详细说明本发明，只是本发明的较佳实施例，并非限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
hoat：n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
dmap：4-二甲氨基吡啶
fmoc：芴甲氧羰基
dic：n，n′-二异丙基碳化二亚胺
hobt：1-羟基苯并三唑
dmf：n，n′-二甲基甲酰胺
nh4i：碘化铵
me2s：二甲硫醚
comu：(2-肟基-氰基乙酸乙酯)-n，n-二甲基-吗啉基脲六氟磷酸酯cas：1075198-30-9
实施例1
(1)fmoc-phe-hmplinkeramide树脂的制备
将0.2mol取代值为0.6mmol/g的hmplinkeramide树脂，加入到固相反应柱中，加入dmf溶胀树脂30分钟后抽干。取0.1molfmoc-phe-oh和0.5mmolhobt，用dmf溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入35mldic和3.2gdmap，室温搅拌反应7小时，抽掉反应液，dmf洗涤2次后，dcm洗涤2次，甲醇洗涤2次，每次洗涤时间为4min，得到fmoc-phe-hmplinkeramide树脂，取代值为0.55mmol/g。
(2)全肽树脂的合成
取0.1mol步骤(1)的fmoc-phe-hmplinkeramide树脂(取代值为0.55mmol/g)，用20％pip/dmf溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去fmoc的h-phe-hmplinkeramide树脂。取0.3molfmoc-asn(trt)和0.3molhobt，用适量dmf溶解；另取0.2molcomu，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应40分钟，加入到上述h-phe-hmplinkeramide树脂中，偶联反应120分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％pip/dmf溶液去保护35分钟，洗涤过滤，得h-asn(trt)-phe-hmplinkeramide树脂。
(3)取步骤(2)所得h-asn(trt)-phe-hmplinkeramide树脂10.0g加入到250ml的三口圆底烧瓶中，按tfa∶tis∶phoh∶phsme∶h2o∶me2s∶nh4i＝70∶8∶6∶4∶4∶4∶4比例配置裂解液100ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量tfa洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀2小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到特立帕肽粗肽。hplc纯度78.80％。
(4)特立帕肽粗肽的初步纯化
使用反相高效液相色谱法对粗肽进行初步纯化，使用的反相高效液相色谱的组成为：极性流动相：a相：体积百分比浓度为0.1％的三氟乙酸(tfa)溶液；b相：乙腈；色谱柱：10μm的c18反相色谱柱；
检测波长：220nm
流速：80ml/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应的增加先以流动相a平衡柱子，然后取粗肽(含肽约21g)4l进样，先用流动相a冲洗20min，然后采用梯度洗脱：洗脱剂为a相与b相的混合，其中b相的体积百分比在45min内由15％上升至40％，密切观察主峰的出现，主峰出现时开始收集，主峰峰顶前、峰顶附近、峰顶后分段收集，无杂峰出现时收集结束。将峰顶出现前、峰顶出现后收集到的液体进行适当浓缩，再加入色谱柱中进行相同的流动相a冲洗与洗脱剂的梯度洗脱，同样收集三段产物，以此重复多次后合并每次收集到的峰顶附近的液体，将其适度地旋转蒸发浓缩，即制得纯化肽的溶液(含量：3.2mg/ml，hplc纯度：97.5％)，可将其冷冻暂存。
(5)特立帕肽粗肽的精制及除盐
使用凝胶色谱法对纯化肽进行精制与除盐，使用的凝胶液相色谱的流动相为：极性流动相：流动相a：水；流动相b：乙腈
色谱填料：葡聚糖凝胶g-25
检测波长：220nm
流速：80ml/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应的增加)
先在室温下，将葡聚糖凝胶干粉分别用乙醇、无盐水、盐酸浸泡后用水洗至中性，并将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内；然后取纯化肽的溶液4551ml进样，上样控制在1～4％的柱体积，脱盐时高径比为5∶1；然后流动相a与流动相b等度洗脱，以时间为节点收集，对于中间时间段的产物合并收集，将其适度地旋转浓缩，即得到所述无盐形式的特立帕肽精制液900ml(含量15.3mg/ml，hplc纯度：99.5％)，可冷冻暂存。
(6)冻干、包装
取特立帕肽的精制液900ml，以0.22μm的滤膜进行过滤，将滤得的固体分装于适当容器中进行冻干，冻干粉用洁净的容器密封包装，经检测合格后入库，即制得特立帕肽成品(hplc纯度99.91％，收率52.2％，杂质met8(o)-特立帕肽含量为0.01％，杂质d-his32-特立帕肽含量为0.01％)。
实施例2
(1)fmoc-phe-hmplinkeramide树脂的制备
将0.5mol取代值为0.65mmol/g的hmplinkeramide树脂，加入到固相反应柱中，加入dmf溶胀树脂30分钟后抽干。取0.1mmolfmoc-phe-oh和0.9mmolhobt，用dmf溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入35mldic和3.2gdmap，室温搅拌反应7小时，抽掉反应液，dmf洗涤2次后，dcm洗涤2次，甲醇洗涤2次，每次洗涤时间为4min，得到fmoc-phe-hmplinkeramide树脂，取代值为0.60mmol/g。
(2)全肽树脂的合成
取0.1mol步骤(1)的fmoc-phe-hmplinkeramide树脂(取代值为0.60mmol/g)，用20％pip/dmf溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去fmoc的h-phe-hmplinkeramide树脂。取0.3molfmoc-asn(trt)和0.3molhobt，用适量dmf溶解；另取0.4molcomu，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应40分钟，加入到上述h-phe-hmplinkeramide树脂中，偶联反应180分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％pip/dmf溶液去保护35分钟，洗涤过滤，得h-asn(trt)-phe-hmplinkeramide树脂。
(3)取步骤(2)所得h-asn(trt)-phe-hmplinkeramide树脂10.0g加入到250ml的三口圆底烧瓶中，按tfa∶tis∶phoh∶phsme∶h2o∶me2s∶nh4i＝70∶8∶6∶4∶4∶4∶4比例配置裂解液100ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量tfa洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀2小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到特立帕肽粗肽，hplc纯度77.50％。按照实施例1所述方法经hplc纯化、精制冻干后hplc纯度99.89％，收率51.3％，杂质met8(o)-特立帕肽含量为0.01％，杂质d-his32-特立帕肽含量为0.01％。
实施例3
(1)fmoc-phe-hmplinkeramide树脂的制备
将0.3mol取代值为0.6mmol/g的hmplinkeramide树脂，加入到固相反应柱中，加入dmf溶胀树脂30分钟后抽干。取0.1molfmoc-phe-oh和0.7molhoat，用dmf溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入35mldic和3.2gdmap，室温搅拌反应7小时，抽掉反应液，dmf洗涤2次后，dcm洗涤2次，甲醇洗涤2次，每次洗涤时间为4min，得到fmoc-phe-hmplinkeramide树脂，取代值为0.55mmol/g。
(2)全肽树脂的合成
取0.1mol步骤(1)的fmoc-phe-hmplinkeramide树脂(取代值为0.55mmol/g)，用20％pip/dmf溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去fmoc的h-phe-hmplinkeramide树脂。取0.3molfmoc-asn(trt)和0.3molhoat，用适量dmf溶解；另取0.3molcomu，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应40分钟，加入到上述h-phe-hmplinkeramide树脂中，偶联反应150分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％pip/dmf溶液去保护35分钟，洗涤过滤，得h-asn(trt)-phe-hmplinkeramide树脂。
(3)取步骤(2)所得h-asn(trt)-phe-hmplinkeramide树脂10.0g加入250ml的三口圆底烧瓶中，tfa∶tis∶phoh∶phsme∶h2o∶me2s∶nh4i＝70∶8∶6∶4∶4∶4∶4比例配置裂解液100ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量tfa洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀2小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到特立帕肽粗肽。hplc纯度79.10％。按照实施例1所述方法经hplc纯化、精制冻干后hplc纯度99.95％，收率52.3％，杂质met8(o)-特立帕肽含量为0.01％，杂质d-his32-特立帕肽含量为0.01％。
综上所述，本发明的有益效果是：本发明选择hmplinker树脂作为固相载体，选择comu作为缩合试剂，裂解试剂采用含nh4i/me2s体系，进行特立帕肽的逐步合成，在保证特立帕肽纯度的前提下提高了其总收率，经过hplc纯化后，杂质d-his32-特立帕肽含量降低到0.1％以下，杂质met8(o)-特立帕肽含量降低到0.1％以下，由本发明所述方法合成的特立帕肽经hplc检测，纯度最高大于99％，最大单一杂质小于0.1％，总收率大于50％。