一种藏红花来源的CCD2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种藏红花来源的ccd2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株。

背景技术：

藏红花酸(crocetin)，又名西红花酸或番红花酸，是西红花提取物的有效成分之一，分子式为c20h24o4。藏红花酸的主要来源是藏红花的柱头，但是藏红花在自然界中的资源非常有限，其柱头产量更是极低，每一朵藏红花一生只能产出三根雌蕊柱头。平均25万朵藏红花，耗费40个小时的人工提取才能获得足够的柱头生产1kg的藏红花粉(saffron)，含量97％的藏红花酸市场售价高达13.6万元/g，因此藏红花享有“植物黄金”的美誉。

在我国的古典医书中记载，藏红花可以活血化瘀、安神解郁、凉血解毒，而现代医药领域对藏红花的研究也发现藏红花可广泛应用于预防和治疗脑血栓、脉管炎、心肌梗塞、惊悸癫狂等疾病。藏红花酸作为藏红花中的天然活性化合物之一，也因其出色的药理药效被人们所熟知，被广泛用于医药、食品加工及化妆品行业。但是藏红花酸的产量极低，导致了供不应求、市场短缺的现象。

目前，藏红花酸的主要生产方法有天然提取、化学合成以及生物合成。天然提取产量极低，易受产地、气候、采摘处理工艺的影响；化学合成主要通过水解藏红花酸二甲酯得到，副产物多，环境污染严重，所合成的藏红花酸由于其较低的纯度只能作为颜料而不能用作食品添加剂或药物。因此，构建高效的微生物细胞工厂合成藏红花酸是最有前途的生产方法。

1982年，pfander等阐明了藏红花酸的天然生物合成路径；2003年，zcd第一次在藏红花中被发现鉴定，被称为7,8(7',8')-玉米黄质裂解双加氧酶；2014年，frusciante等证明zcd在大肠杆菌和玉米胚乳中均不能合成藏红花酸，而新发现的藏红花来源的ccd2证实可在玉米黄质的7,8和7',8'处进行催化裂解，合成藏红花酸二醛；2017年，chaif等在酿酒酵母中利用藏红花来源的ccd2首次实现了藏红花酸的从头合成，摇瓶发酵产量达633ug/l(chaif,etal.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae[j].microbialcellfactories,2017)，此外该研究还对内源外源ald进行筛选(藏红花酸产量由240μg/l提至633μg/l)；调节ccd2与ald的表达强度(藏红花酸产量由633μg/l提至至1219μg/l)。

藏红花来源的ccd2是目前发现的唯一一个能在酿酒酵母中催化玉米黄质合成藏红花酸的ccd家族成员，但文献报道ccd2也不能在其他位点催化β-胡萝卜素和番茄红素，即ccd2可识别的底物谱中不包括β-胡萝卜素和番茄红素；目前，虽然实现了藏红花酸在酿酒酵母中的合成，但通过番茄红素-β-胡萝卜素-玉米黄质-藏红花醛-藏红花酸的长路径天然产物的异源合成面临路径中基因与基因之间、路径基因与底盘之间的适配问题。同时，随着路径的延长，总产率不断降低，产量依旧很低。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藏红花来源的ccd2突变体及其编码序列，使得所述ccd2突变体及其编码序列用于构建生产藏红花酸重组酵母菌株时，能够直接以β-胡萝卜素为底物生产藏红花酸和/或提高以玉米黄质为底物生产藏红花酸的效率；

本发明的另外一个目的在于提供一种表达ccd2突变体的重组载体，使得所述重组载体用于构建生产藏红花酸重组酵母菌株时，能够直接以β-胡萝卜素为底物生产藏红花酸和/或提高以玉米黄质为底物生产藏红花酸的效率；

本发明的另外一个目的在于提供一种生产藏红花酸的重组酵母菌株，使得所述重组酵母菌株能够直接以β-胡萝卜素为底物生产藏红花酸和/或提高以玉米黄质为底物生产藏红花酸的效率。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种藏红花来源的ccd2突变体，具有如下一种或两种以上的位点突变：

v120f、y190k/a、r192v/f、e211a、e212a、t290v、k320a、s323f/a/t。

针对目前藏红花酸合成路径过长以及对原有底物玉米黄质催化效率不高的问题，本发明对藏红花酸合成途径中的限速酶ccd2进行突变改造，使其能够直接利用β-胡萝卜素为底物生产藏红花酸，缩短合成路径，并可以提高催化玉米黄质生成藏红花酸的效率。

作为优选，所述藏红花来源的ccd2突变体具有s323f/a/t位点突变和/或具有如下一种或两种以上的位点突变：

v120f、y190k/a、r192v/f、e211a、e212a、t290v、k320a。

在本发明具体实施方式中，所述藏红花来源的ccd2突变体具有如下任意一种情形的位点突变：

(1)s323f/a位点突变+r192v/f位点突变；

(2)s323f/a位点突变+t290v位点突变；

(3)s323f/a位点突变+r192v/f位点突变+t290v位点突变。

同时，本发明还提供了上述藏红花来源的ccd2突变体的编码序列；野生型藏红花来源的ccd2的编码序列如seqidno:1所示，其中，第358-360bp的碱基gtt表达ccd2第120位的缬氨酸(v)，可突变为ttc表达苯丙氨酸(f)；

第568-570bp的碱基tac表达ccd2第190位的酪氨酸(y)，可突变为aag表达赖氨酸(k)或突变为gct表达丙氨酸(a)；

第574-576bp的碱基aga表达ccd2第192位的精氨酸(r)，可突变为gtt表达缬氨酸(v)或突变为ttc表达苯丙氨酸(f)；

第631-633bp的碱基gaa表达ccd2第211位的谷氨酸(e)，可突变为gct表达丙氨酸(a)；

第634-636bp的碱基gaa表达ccd2第212位的谷氨酸(e)，可突变为gct表达丙氨酸(a)；

第868-870bp的碱基act表达ccd2第290位的苏氨酸(t)，可突变为gtt表达缬氨酸(v)；

第958-960bp的碱基aaa表达ccd2第320位的赖氨酸(k)，可突变为gct表达丙氨酸(a)；

第967-969bp的碱基tcc表达ccd2第323位的丝氨酸(s)，可突变为ttc表达苯丙氨酸(f)、突变为gct表达丙氨酸(a)或突变为act表达苏氨酸(t)。

通过将所述ccd2突变体的编码序列接入载体并转化到酵母菌株中，可实现本发明预期的目的，故本发明提出了所述ccd2突变体的编码序列在制备表达所述ccd2突变体的重组载体和/或生产藏红花酸的重组酵母菌株中的应用。

根据所述ccd2突变体的编码序列的应用，本发明提供了一种重组载体，其在基础载体上接入所述ccd2突变体的编码序列。

作为优选，所述重组载体在基础载体上接入启动子+所述ccd2突变体的编码序列+终止子的表达盒；在本发明具体实施方式中，该表达盒中的启动子优选gal启动子，如gal10启动子、gal7启动子；所述终止子优选tef2终止子或pgi1终止子。

在生产藏红花酸的酵母菌株中，ald可通过其他载体表达，也可与ccd2突变体通过同一重组载体表达，故在所述基础载体上还可包含ald编码序列；在本发明具体实施方式中，所述ald编码序列为来源于集胞藻属的syn_ald编码序列(synechocystissp.pcc6803)。作为优选，ald编码序列以启动子+ald编码序列+终止子的表达盒连接在基础载体上；在本发明具体实施方式中，该表达盒中的启动子优选gal启动子，如gal10启动子、gal7启动子；所述终止子优选tef2终止子或pgi1终止子。

在本发明具体实施方式中，所述基础载体选择prs系列质粒，如prs416、prs425k等。基于同样的技术效果，本发明提出了所述重组载体在构建生产藏红花酸重组酵母菌株中的应用。所述酵母菌株优选为酿酒酵母，更优选为cen.pk系列酿酒酵母或by系列酿酒酵母。

此外，本发明还提供了所述重组载体的构建方法，在所述ccd2突变体的编码序列两端构建同源臂，酶切基础载体为线性载体，通过酵母同源重组将所述编码序列接入到基础载体上。

较为具体的方法为，构建上游同源臂+启动子+所述ccd2突变体的编码序列+终止子+下游同源臂的表达盒，在基础载体所述上游同源臂和下游同源臂连接处酶切成为线性载体，通过酵母同源重组将所述ccd2突变体的编码序列接入到基础载体上；或

构建上游同源臂+启动子+所述ccd2突变体的编码序列+终止子的表达盒或启动子+所述ccd2突变体的编码序列+终止子+下游同源臂的表达盒，在基础载体所述上游同源臂和终止子连接处酶切成为线性载体或在基础载体所述启动子和下游同源臂连接处酶切成为线性载体，通过酵母同源重组将所述ccd2突变体的编码序列接入到基础载体上；或

构建启动子+所述ccd2突变体的编码序列+终止子的表达盒，在基础载体上的所述启动子和终止子连接处酶切成为线性载体，通过酵母同源重组将所述ccd2突变体的编码序列接入到基础载体上；

同时，本发明也提供了同时接入所述ccd2突变体的编码序列以及ald编码序列的重组载体的构建方法，即分别在所述ccd2突变体的编码序列和ald编码序列两端构建同源臂，酶切基础载体为线性载体，通过酵母同源重组将所述ccd2突变体的编码序列和ald编码序列接入到基础载体上。在本发明具体实施方式中，所述构建方法为构建上游同源臂+第一启动子+所述ccd2突变体的编码序列+第一终止子、第一终止子+第二启动子+ald编码序列+第二终止子的表达盒，在基础载体上的所述上游同源臂和第二终止子连接处酶切成为线性载体，通过酵母同源重组将所述ccd2突变体的编码序列和ald编码序列接入到基础载体上；所述第一启动子、第二启动子、第一终止子和第二终止子的选择同前述启动子和终止子。

在上述构建方法中，根据基础载体上所具备的各基因元件，可相应的在需要接入的外源基因或其表达盒两端添加相同基因元件序列，称为同源臂；对于需要导入多个外源基因或其表达盒的情形，保证相邻外源基因或其表达盒具备重叠的同源臂序列，最后再与酶切的线性基础载体两端具备重叠的同源臂序列即可将多个外源基因或其表达盒一同接入到基础载体上。出于简便的考虑，也可以直接采用表达盒的启动子和终止子作为同源臂，无需额外再设计同源臂。

以本发明具体实施方式中的一种构建方法为例说明，构建his5终止子(上游同源臂)+gal10启动子+所述ccd2突变体的编码序列+tef2终止子、tef2终止子+gal7启动子+ald编码序列+pgi1终止子的表达盒，在基础载体上的his5终止子和pgi1终止子连接处酶切(根据实际的酶切位点选择合适的酶)成为线性载体，通过酵母同源重组将所述ccd2突变体的编码序列和ald编码序列接入到基础载体上，示意图见图1。

本发明还提供了一种生产藏红花酸的重组酵母菌株，其转化有本发明所述重组载体；如所述酵母菌株本身能够表达ald或转化有表达ald的重组载体，那么只需转化接入了所述ccd2突变体的编码序列的重组载体即可；在具体的转化过程中，通过将各个表达盒和酶切的线性基础载体一同转化至酵母中，通过同源重组机制，即可在酵母内部完成重组载体的组装并实现蛋白的表达，故所述重组酵母菌株可应用在生产藏红花酸中。

在生产藏红花酸的方法中，直接采用本发明所述重组酵母菌株以玉米黄质和/或β-胡萝卜素为底物进行发酵即可。一般先通过种子培养基活化，再通过发酵培养基发酵。

在本发明具体实施方式中，所述种子培养基为合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/l；其中，混合氨基酸粉末中所缺氨基酸根据载体所含筛选标签确定；

所述发酵培养基为40g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉，10g/ld-半乳糖；

具体的生产方法为，将所述重组酵母菌株接种于5ml种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h；以初始od600＝0.2转接至5ml新鲜种子培养基中，30℃、250rpm培养12h；以初始od600＝0.1转接至50ml发酵培养基中，20℃、250rpm条件下发酵培养；发酵时间为96-144h，且随时间延长产量增加。

由以上技术方案可知，本发明针对藏红花酸合成路径中的限速酶ccd2进行改造，通过拓宽ccd2的底物谱，实现从β-胡萝卜素直接合成藏红花酸，对现有的藏红花酸合成路径精简重构，从而解决多步反应总产率普遍低的问题；同时提高ccd2催化原底物玉米黄质合成藏红花酸的效率，进而获得一株高产藏红花酸的酵母菌株。

附图说明

图1所示为本发明所述重组载体的构建示意图；

图2所示为prs416-c-01质粒图谱；

图3所示为prs416-a-01质粒图谱；

图4所示为prs425k-a-04质粒图谱；

图5所示为构建本发明所述重组酵母菌株的流程示意图；

图6所示为以β-胡萝卜素为底物ccd2单点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵结果；

图7所示为以β-胡萝卜素为底物ccd2多点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵结果；

图8所示为以玉米黄质为底物ccd2单点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵结果；

图9所示为以玉米黄质为底物ccd2s323位点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵结果；

图10所示为以玉米黄质为底物ccd2多点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵结果。

具体实施方式

本发明公开了一种藏红花来源的ccd2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述突变体、重组载体、菌株以及构建方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的突变体、重组载体、菌株以及构建方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所出现的序列均优选经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制酶切位点；

his5终止子序列如seqidno:2所示；

gal10启动子序列如seqidno:3所示；

tef2终止子序列如seqidno:4所示；

gal7启动子序列如seqidno:5所示；

synald编码序列如seqidno:6所示；

pgi1终止子序列如seqidno:7所示；

此外，prs416-c-01质粒全基因序列如seqidno:8所示，质粒图谱如图2所示；

prs416-a-01质粒全基因序列如seqidno:9所示，质粒图谱如图3所示；

prs425k-a-04质粒全基因序列如seqidno:10所示，质粒图谱如图4所示；

上述各基因元件序列可按照本发明所述表达盒情形进行顺序连接，即为对应表达盒的序列。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：构建本发明所述重组酿酒酵母菌株

1.底盘菌株

可选择能够高产β-胡萝卜素和/或玉米黄质的酿酒酵母菌株或普通酿酒酵母菌株(普通菌株发酵时需添加β-胡萝卜素和/或玉米黄质作为底物)；

2.外源功能基因元件及模块化整合工具质粒的获得

ccd2基因元件：以prs416-c-01质粒为模板扩增获得(其上有表达盒his5t-gal10p-ccd2-tef2t)；

synald基因元件：以prs425k-a-04质粒为模板扩增获得(其上有表达盒tef2t-gal7p-synald-pgi1t)；

基础载体为prs416-a-01质粒，其上有his5t-pgi1t基因元件；

上述各基因元件、质粒或表达盒也可以直接采用全合成方式直接获得。

3.表达盒以及线性化载体的构建

表达盒一的构建：以prs416-c-01为模板，通过pcr将所需的突变点引入ccd2，得到ccd2_mut表达盒his5t-gal10p-ccd2_mut-tef2t。具体如下，以prs416-c-01为模板，通过设计引物分别进行两个pcr反应得到含ccd2突变位点的两个dna片段，即his5t-gal10p-ccd2_mut-frag1和ccd2_mut-frag2-tef2t，再以这两个片段为模板进行oepcr反应即可得到ccd2_mut表达盒his5t-gal10p-ccd2_mut-tef2t。有多个突变位点的表达盒参照上述方法构建，区别在于设计引物的多少和pcr反应次数以及得到的片段数，最终均通过相邻片段之间的重叠序列以oepcr反应连接。

表达盒二的构建：用psti/bamhi双酶切质粒prs425k-a-04即可得到synald表达盒tef2t-gal7p-synald-pgi1t，tef2t的添加是为了能够与表达盒一有同源臂，使两者能够连接。

线性化基础载体的构建：用bamhi酶切质粒prs416-a-01，其从his5t和pgi1t之间断开，获得线性化基础载体，表达盒一和表达盒二上的his5t和pgi1t作为同源臂可与线性化基础载体连接，形成重组载体。

4.通过酵母同源重组构建生产藏红花酸的酿酒酵母菌株

采用醋酸锂法将表达盒一的突变体ccd2_mut基因连同表达盒二和线性化基础载体共转化至底盘菌株中，使突变体ccd2_mut基因和synald基因共同存在于着丝粒质粒prs416，转化后的酵母涂布sc-trp-leu-his-ura固体板(合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/l，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子划线分纯培养后挑单菌落接菌于sc-trp-leu-his-ura液体培养基提取酵母质粒进行pcr验证，pcr验证正确的酵母质粒回转大肠杆菌提质粒测序。

本实施例整体构建流程示意图见图5。

实施例2：ccd2单点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵试验(β-胡萝卜素底物)

1、试验菌株

各组底盘菌株均为专利201510435606.2中的高产β-胡萝卜素的菌株sybe_sc14cy03。

对照菌株1：参照实施例1中的构建方法构建，区别在于，以野生型ccd1基因替换ccd2基因，即区别在于表达盒一为his5t-gal10p-ccd1-tef2t，菌株编号为sybe_sc02070246；

对照菌株2：参照实施例1中的构建方法构建，区别在于，ccd2基因为野生型未突变基因，即区别在于表达盒一为his5t-gal10p-ccd2-tef2t；

本发明重组菌株1：位点突变选择为s323f，即表达盒一为his5t-gal10p-ccd2_mut9(s323f)-tef2t，菌株编号为sybe_sc02070192；

本发明重组菌株2：位点突变选择为s323a，即表达盒一为his5t-gal10p-ccd2_mut19(s323a)-tef2t，菌株编号为sybe_sc02070248；

2、摇瓶发酵方法和藏红花酸检测

种子培养基(sc-trp-leu-his-ura)：合成酵母氮源ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/l；

发酵培养基：40g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母浸粉，10g/ld-半乳糖。

将上述各组菌株甘油菌接种于5ml种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h；以初始od600＝0.2转接至5ml新鲜种子培养基中，30℃、250rpm培养12h；以初始od600＝0.1转接至50ml发酵培养基中，20℃、250rpm条件下发酵培养96h时检测藏红花酸产量。

藏红花酸提取方法：每个发酵瓶均取2ml发酵液，12000rpm离心2min收集菌体，无菌水洗两次后用以产物提取。具体方法为：用3mhcl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min，反复四次；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心5min弃上清，无菌水洗2次后加入1ml丙酮，并涡旋5min，反复多次至菌体变为白色；离心富集丙酮相，并用真空离心浓缩仪将丙酮挥发干净，加入400μl的dmf：甲醇＝1:7，并用2μm有机滤膜过滤后用hplc检测。

藏红花酸hplc检测方法：bdshypersilods-2c18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，waters2489uv/vis检测器；waterse2695泵；流动相：甲醇：超纯水(2％甲酸)＝70:30；上样体积：30μl；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测波长：430nm。

3、结果

根据图6结果可以看出，ccd2的两种突变体s323f和s323a都实现了从β-胡萝卜素合成藏红花酸，而导入野生型ccd2和ccd1的重组菌株均未有藏红花酸的产生。

实施例3：ccd2多点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵试验(β-胡萝卜素底物)

根据实施例1的构建方法构建重组菌株，底盘菌株同实施例2，选择如下ccd2多点突变，各组表达盒一如下：

his5t-gal10p-ccd2_mut24(r192f&s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut25(r192f&s323a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut26(t290v&s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut27(t290v&s323a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut28(r192f&t290v&s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut29(r192f&t290v&s323a)-tef2t.

菌株编号依次为sybe_sc02070264-sybe_sc02070269；

结果见图7，以s323a突变组合其他突变可使重组酿酒酵母藏红花酸生产量相对单点突变得到明显提高，产量最高达180ug/l左右。

实施例4：ccd2单点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵试验(玉米黄质底物)

根据实施例1的构建方法构建重组菌株，底盘菌株选择文献fenghuachai.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae.microbialcellfactories.2017.16(1).中的高产玉米黄质的菌株sybe_sc0123cz14，选择如下ccd2单点突变，各组表达盒一如下：

his5t-gal10p-ccd2_mut9(s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut10(v120f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut11(y190k)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut12(y190a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut13(r192v)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut14(r192f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut15(e211a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut16(e212a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut17(t290v)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut18(k320a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut19(s323a)-tef2t.

菌株编号依次为sybe_sc02070170和sybe_sc02070177-sybe_sc02070186；

对照菌株选自文献fenghuachai.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae.microbialcellfactories.2017.16(1).中的产藏红花酸的菌株sybe_sc0123c050(wt)；

结果见图8，s323a、s323f、k320a、t290v、r192f以及r192v单点突变的重组酿酒酵母相比sybe_sc0123c050，均可以提高催化玉米黄质生产藏红花酸的效率，产量均有所提高，其中以s323a、s323f两种位点突变提高较为显著。

实施例5：ccd2的s323位点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵试验(玉米黄质底物)

根据实施例1的构建方法构建重组菌株，底盘菌株选择文献fenghuachai.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae.microbialcellfactories.2017.16(1).中的高产玉米黄质的菌株sybe_sc0123cz14，选择如下ccd2的s323位点突变，各组表达盒一如下：

his5t-gal10p-ccd2_mut9(s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut19(s323a)-tef2t

his5t-gal10p-ccd2_mut21(s323h)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut22(s323e)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut23(s323t)-tef2t.

菌株编号依次为sybe_sc02070110，sybe_sc02070111，sybe_sc02070249-sybe_sc02070251；同时

对照菌株选自文献fenghuachai.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae.microbialcellfactories.2017.16(1).中的产藏红花酸的菌株sybe_sc0123c050(wt)；

结果见图9，s323a、s323f、s323t单点突变的重组酿酒酵母相比sybe_sc0123c050，均可以显著提高催化玉米黄质生产藏红花酸的效率，产量显著提高。

实施例6：ccd2多点突变的重组酿酒酵母的藏红花酸摇瓶发酵试验(玉米黄质底物)

根据实施例1的构建方法构建重组菌株，底盘菌株选择文献fenghuachai.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae.microbialcellfactories.2017.16(1).中的高产玉米黄质的菌株sybe_sc0123cz14，选择如下ccd2的多位点突变，各组表达盒一如下：

his5t-gal10p-ccd2_mut24(r192f&s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut25(r192f&s323a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut26(t290v&s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut27(t290v&s323a)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut28(r192f&t290v&s323f)-tef2t；

his5t-gal10p-ccd2_mut29(r192f&t290v&s323a)-tef2t.

菌株编号依次为sybe_sc02070252-sybe_sc02070257；

对照菌株选自文献fenghuachai.heterologousbiosynthesisandmanipulationofcrocetininsaccharomycescerevisiae.microbialcellfactories.2017.16(1).中的产藏红花酸的菌株sybe_sc0123c050(wt)；

结果见图10，上述各多点突变组合的重组酿酒酵母相比sybe_sc0123c050，均可以显著提高催化玉米黄质生产藏红花酸的效率，产量显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>天津大学

<120>一种藏红花来源的ccd2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株

<130>mp1833204

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1689

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>725

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>1371

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<211>450

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccg660

ccaagtacaattttttactcttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtca720

aattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcac780

acggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcagaagaagtaacaa840

aggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctatctactg900

gagaatatactaagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggct960

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