一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用，尤其是涉及一株不产芽胞、晶体蛋白合成量增加、杀虫性能稳定、对环境安全的苏云金芽胞杆菌菌株(bacillusthuringiensisδleub)及其应用。

背景技术：

苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis，简称bt)是一种自然界广泛分布的革兰阳性细菌，其主要特征是在菌体形成芽胞的同时，伴随有大量杀虫晶体蛋白(包括cry和cyt晶体蛋白)的产生，bt伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有毒杀作用。因此苏云金芽胞杆菌作为微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业和卫生害虫的防治。然而，与传统的化学农药相比，bt制剂在田间应用中稳定性差，杀虫持效期相对较短；防治效果易受外界气候和生态条件影响，从而成为制约该杀虫剂发展的瓶颈。因为bt制剂的活性成分是其所产生的杀虫晶体蛋白，容易受到阳光辐射、温度等天气环境因素的限制，其中紫外线辐射引起的蛋白降解被认为是bt杀虫剂在田间条件下药效迅速损失最关键的影响因素。另一方面，商品化的bt制剂一般是杀虫晶体蛋白和芽胞的混合物，芽胞具有很强的抗逆性，这种bt制剂活芽胞的大面积喷洒和释放会对周边环境的生态带来潜在威胁和破坏。所以，开发杀虫性能稳定、对生态与环境更安全的新一代bt生物农药十分必要。通过分子遗传改良手段和方法获得无芽胞释放的bt菌株为实现此目标的重要策略。

在bt中，leub基因编码的是3-异丙基苹果酸脱氢酶(3-isopropylmalatedehydrogenase,ipmdh,ec:1.1.1.85)，为亮氨酸生物合成途径中的一个关键酶。但是目前对于该基因的研究仅限于基因克隆及其蛋白表达产物的结构特征或酶学活性分析。而在许多真菌细胞中，leub不仅调控亮氨酸的生物合成，更是扮演着转录调控因子的角色。在真菌烟曲霉中，leub通过与细胞内参与氮代谢和铁离子平衡相关基因的启动子结合，影响烟曲霉在低铁环境下的生长。

苏云金芽胞杆菌杀虫谱十分广泛，其作用范围涵盖多种鳞翅目、鞘翅目农业害虫，受到研究者的广泛关注。构建杀虫毒力高、无芽胞释放、安全稳定的bt工程菌株具广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用，该苏云金芽胞杆菌在lb液体培养基中无成熟芽胞，晶体蛋白合成量增加且母细胞不裂，能延长对靶标昆虫的持效期，杀虫性能稳定，对环境安全。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，本发明之杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌δleub(bacillusthuringiensisδleub)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为cctccno：m2019112。

本发明之苏云金芽胞杆菌δleub，其核苷酸序列如序列表seqidno:1所示(在bt4.0718野生型菌株中缺失leub基因)：

本发明之苏云金芽胞杆菌δleub，其核苷酸编码的leub缺失的蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno:2所示(核苷酸序列最后三位taa是终止子)：

本发明之杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌在杀虫方面的应用，尤其是适于杀鳞翅目昆虫如小菜蛾、棉铃虫等。

本发明通过分子遗传改良手段和方法构建bt工程菌株，从根本上构建出既具高效杀虫活性又无芽胞释放、对环境安全的bt菌株，继而能工业化生产的bt工程菌。

本发明之苏云金芽胞杆菌δleub，在lb液体培养基中能正常形成晶体、但无成熟芽胞，晶体蛋白合成量增加，菌体母细胞裂解完全受阻，晶体蛋白被包裹形成微包囊，既能够帮助晶体蛋白有效抵抗紫外降解，延长对靶标昆虫的持效期，提高杀虫稳定性，突变株对小菜蛾杀虫毒性相比野生菌增强，又能很好的解决芽胞释放带来的环境安全问题，对解决bt制剂施用过程中的杀虫持效期短和生态安全问题具有一定的应用价值。

本发明利用i-scei介导的基因无痕敲除系统对苏云金芽胞杆菌bt4.0718基因组中的leub基因成功进行敲除，得到一株苏云金芽胞杆菌突变株，δleub突变株表型变化明显：在lb液体培养基中无成熟芽胞、晶体蛋白合成量增加且母细胞不裂、晶体蛋白被包裹形成微包囊；突变菌对小菜蛾杀虫活性毒力较野生菌有提高，差异较显著。

微生物菌株保藏情况说明

苏云金芽胞杆菌δleub(bacillusthuringiensisδleub)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为cctccno：m2019112。

附图说明

图1为敲除载体prp8509的构建和鉴定图；

图2为δleub突变株的pcr验证图；

图3为bt4.0718与δleub突变株在lb培养基中的生长曲线测定结果图；

图4为bt4.0718与δleub突变株在lb培养基中不同时期菌体形态相差显微镜观察图；

图5为bt4.0718与δleub突变株芽胞和晶体的透射电镜观察图；

图6为bt4.0718与δleub突变株菌体全蛋白sds-page检测图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本说明书中，除另有说明外，所述百分比为质量百分比。

实施例

①本实施例之苏云金芽胞杆菌δleub(bacillusthuringiensisδleub)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为cctccno：m2019112。

②本实施例之苏云金芽胞杆菌δleub构建过程：

第一步：构建敲除载体prp8509：以野生型bt4.0718菌株基因组为模板，各采用两对引物ulueb-f/ulueb-r和dlueb-f/dlueb-r(引物序列见表1，由上海生工生物技术有限公司合成)进行pcr扩增获得leub基因的上、下游同源臂，pcr产物的大小分别为690bp和660bp(图1a-b)。将上游同源臂用bamhi/sali双酶切并回收产物，与经过同样双酶切回收处理的prp1028载体(由华中农业大学何进教授惠赠)连接并转化，从抗性板上挑取阳性克隆子，提取质粒进行双酶切鉴定，目的片段大小与预期相符(图1-c)，得到的重组质粒命名为prpuleub；采用同样的方法将下游同源臂经sali/kpni连接至中间质粒prpuleub相应的多克隆位点，经sali/kpni双酶切重组质粒鉴定出的目的片段大小与预期相符(图1-d)，证明重组载体已成功连上leub基因的上、下游同源臂，被命名为敲除载体prp8509。

所述野生型bt4.0718菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno.m200016，参见中国专利zl01114592.7。

表1pcr引物

第二步：将敲除载体prp8509通过三亲本接合转移实验导入野生型bt4.0718菌株内：首先通过同源单交换，将敲除载体prp8509整合到基因组中；然后通过i-scei归巢内切酶介导的第二次同源单交换，即得苏云金芽胞杆菌leub缺失突变株δleub。经过两次接合转移后挑取阳性转化子进行菌落pcr验证，共采用两对检测引物。第一对引物为ulueb-f/dlueb-r(leub上游同源臂的正向引物和下游同源臂的反向引物)，经琼脂糖凝胶电泳检测，观察到与预期的1350bp大小相一致的目的条带，证明leub基因敲除成功(图2-a)。第二对引物为leub-f/leub-r(扩增leub基因的编码框)，结果显示：野生型菌株bt4.0718中扩增出与预期大小相符的目的条带(1100bp)，而敲除菌中无特异性扩增条带，再次证明了leub基因被成功敲除(图2-b)。

③本实施例之野生型bt4.0718菌株(以下简称bt4.0718)与突变菌苏云金芽胞杆菌δleub(以下简称δleub)在lb培养基中生长曲线测定及不同时期菌体的相差显微镜观察：bt4.0718与δleub突变株以lb液体培养基过夜活化后，按照1％比例分别转接于lb培养基继续培养，每组设置三个平行。每隔一定时间(2h)取一定体积培养物，以新鲜lb培养基作为空白对照，利用分光光度计测定od600值(od600值在0.1-1.0之间，若超过此数值，则进行适当稀释)，以同步反应菌体生长密度。以培养时间为横坐标、培养物od600值为纵坐标绘制生长曲线。

图3为bt4.0718与δleub突变株在lb培养基中的生长曲线测定结果图，显示leub基因的敲除没有影响到细胞的生长；且在延滞期、对数生长期和稳定期前、中期，两株菌的生长曲线没有显著差异，但从26h开始(稳定期后期)，bt4.0718菌株由于菌体的迅速裂解，导致培养物的od600值急剧下降，然而δleub的od600值还始终维持在比较平稳的状态。

④本实施例不同时期菌体的相差显微镜观察：

取少量步骤③生长曲线测定时不同时间点的培养物，10000rpm离心2min收集菌体，弃尽培养基，用适量无菌ddh2o洗涤2-3次后，加少量ddh2o重悬菌体，取约10μl滴加于载玻片上，盖上盖玻片、压片，用100×相差显微镜观察。

图4为δleub突变株和野生菌在lb培养基中不同时期的菌体生长形态显微镜观察图，结果显示，在28h时(稳定期后期)，bt4.0718有典型的卵圆形芽胞和菱形晶体，并且小部分菌体裂解，芽胞和晶体随之释放；同时期的δleub突变株无芽胞，菌体内可见规则的菱形晶体，菌体无裂解迹象。培养至84h时，bt4.0718细胞早已裂解，而δleub突变株依然无裂解现象，菌体内包裹的菱形晶体体积比28h时进一步增大，有的甚至达到母细胞体积的1/3。取两株菌lb培养的菌体(24h)进行透射电镜观察，结果进一步确认δleub突变株只产晶体、无成熟芽胞形成(图5)。图5中s为芽胞，c为晶体，图5中a为lb中培养的bt4.0718芽胞和晶体的透射电镜观察图；图5中b为lb中培养的δleub突变株芽胞和晶体的透射电镜观察图；

⑤本实施例之bt4.0718与δleub突变株在lb培养基中全蛋白sds-page检测图。

(1)菌体全蛋白的提取

lb液体培养基过夜活化的bt4.0718与δleub突变株按1％的比例分别转接于30ml发酵培养基，取相应时间点的发酵液，10000rpm4℃2min离心收集菌体(100μl菌体)，弃尽培养基，沉淀用预冷的pbs清洗三遍。每管加入300μl的细胞裂解液重悬菌体沉淀，然后加入蛋白酶抑制剂10μl和pmsf(苯甲基磺酰氟)5μl，混匀后冰上静止5分钟，按照3s、3s、5min的设置参数冰浴超声两次破碎细胞，14000rpm4℃20min离心，取上清(菌体全蛋白溶液)转移分装至新的离心管，-80℃保存备用。

(2)蛋白含量测定

采用bradford法对步骤(1)提取的菌体蛋白含量进行定量：

取10μl蛋白标准品(5mg/mlbsa)用pbs溶液稀释至100ul，使其终浓度为0.5mg/ml；将稀释后标准品(0.5mg/mlbsa)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到96孔板中，加pbs溶液补足至20μl；加适当体积样品到96孔板中，加pbs溶液稀释到20μl，同时设置3个重复；各孔加入200μlbradford染色液，轻轻用加样枪吹打均匀(注意不要弄出气泡影响读数)室温放置3-5min；用酶标仪测定a595波长的od值，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

(3)蛋白样品的sds-page检测

取步骤(2)提取的各全蛋白样品80μl于一新的ep管中，各加入20μl5×sds-page上样缓冲液，沸水浴10min后，12000r/min离心3min，取上清点样进行sds-page分析，点样体积按照上一步测得的蛋白浓度进行计算，每个孔的蛋白量统一为12μg。电泳完毕后，sds-page胶块用考马斯亮蓝染色液染色4h，然后用脱色液脱色至可看到清析明亮条带，用microtekbio-5000蛋白胶扫描仪对实验结果进行扫描成像。

图6是lb培养基中28h和48h的菌体、提取全蛋白进行sds-page检测图，图中m：蛋白maker,1:bt4.0718(28h),2:δleub突变株(28h)；3:bt4.0718(48h)；4:δleub突变株(48h)。

结果显示：28h时位于约130kda处的cry蛋白产量有显著差异，与野生菌相比，δleub突变株中位于约130kda处的cry蛋白条带产量增加。48h时，δleub突变株因菌体依然未裂解，全蛋白带型与之前28h相比几乎无差异，但是野生菌因菌体早已裂解，菌体中的小分子量蛋白缺失导致全蛋白带型与之前相比已发生改变。

⑥本实施例之杀虫活性测试

bt4.0718与δleub突变株分别在lb液体培养基中培养至72小时，按标准生测方法配置人工饲料，将不同体积的发酵液加入30ml生测饲料混合均匀(共设5或7个浓度梯度)，均匀倒入24孔细胞培养板中，每个处理设置三个重复；饲料干燥后接入初孵棉铃虫(helicoverpaarmigera)或小菜蛾(plutellaxylostella)，置于人工气候箱中饲养，相对湿度65±5％，温度27±1℃，光照周期为12：12h(l/d)培养。48h和72h统计致死率(小菜蛾为24h和48h)，采用spss软件计算lc50值。

δleub与bt4.0718的杀虫毒力比较

δleub与bt4.0718各自培养72h的晶胞混合物(液体lb中生长的δleub，将菌体超声后的晶体悬浊液)对小菜蛾(spodopteraexigua)和棉铃虫(helicoverpaarmigera)的生测结果显示，δleub对小菜蛾和棉铃虫的杀虫毒力lc50值(表2)。

表2bt4.0718与δleub晶胞混合物(lb)对小菜蛾和棉铃虫的毒性lc50分析

由表中结果可知，本发明之δleub突变株较野生菌bt4.0718对小菜蛾杀虫活性毒力有提高，差异较显著；对棉铃虫lc50差异不显著。

序列表

<110>湖南师范大学

<120>一株杀虫性能好、对环境安全的苏云金芽胞杆菌及其应用

<160>2

<210>1

<211>1065

<212>dna

<213>苏云金芽胞杆菌δleub（bacillusthuringiensisδleub）

<220>

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