本发明涉及农药的制备方法，具体地指一种l-草铵膦的制备方法。
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：草铵膦，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-dl-高丙氨酸，由赫斯特公司(现德国拜耳公司)于上个世纪80年代开发生产，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，非选择性触杀型除草剂，其作为除草剂获得登记使用是1984年。2004年我国才有草铵膦原药登记，2005年我国才有产品登记。草甘膦自广泛应用以来，抗草甘膦杂草不断增加，危害逐步加重。百草枯是一种强烈的杀灭杂草除莠剂，对人畜有很强的毒性作用。2014年7月1日，我国撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。草铵膦是世界大吨位农药品种，也是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦毒性低，较为安全，在土壤中易于降解，对作物安全，不易飘移，除草谱广，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速，能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草，可用水做基剂，使用安全方便，这些是该品优于其他除草剂的特点，所以这个产品在出现了众多高效超高效的产品后，依然可以畅销。目前国内外草铵膦的合成技术路线较多，严海昌等(《农药》，2002，41(9)，46-48)做过综述报道，但各路线普遍存在反应步骤多，生产成本高的问题。拜尔公司在专利us4521348及us6359162中提出了以合成二氯甲基膦再合成甲基亚磷酸酯，经过一系列反应合成草铵膦的方法。该路线收率高、成本低，但起始路线二氯甲基膦合成原料、产物物化性质活泼，易燃易爆。合成过程处于500～600℃，如控制不稳定，容易产生极易自然的黄磷和磷化氢，危险性很大。另外，物料具有强腐蚀性，对反应设备材质选择及其加工制造工艺要求苛刻，目前国内加工制造水平难以满足生产要求。这些方法都是制备草铵膦的方法，草铵膦为l/d混合型，其中起主要作用的是l型；l-草铵膦可在土壤中经微生物降解，而d-型草铵膦较难降解，最终可导致土壤板结。因此，l-草铵膦比较传统草铵膦更加高效、更低成本、更加安全。因此，研发一种能提高原料利用率、降低生产成本同时避免工业化过程中的危险性的l-草铵膦的生物合成制备方法显得十分必要。技术实现要素：本发明所要解决的问题就是要克服
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的不足，提供一种l-草铵膦的制备方法，能提高原料利用率、降低生产成本，并且适合工业化生产。本发明提供了式i化合物的制备方法，由式v化合物反应得到，反应式如下：r2选自氨基或-or0；r0选自氢、烃基、硅烷基、苄基、烷基甲基、烷基取代烷氧基、3-8元脂环族基、芳基、杂芳基、取代芳基、取代杂芳基、ar(ch2)no-基团中的一种，ar代表芳基、杂芳基，n取1-6；r1选自烃基、芳基、杂芳基、取代烃基、取代芳基、取代杂芳基。进一步地，l-草铵膦的制备方法，由式iv化合物反应制备式ii化合物，反应式如下，脱保护基即得到l-草铵膦，其中，r3选自氢、烷基、硅烷基、硅醚保护基、苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、c2-c10直链或支链烯烷基、c2-c10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、氨基、取代氨基、ar(ch2)a-基团中的一种，ar代表芳基、杂芳基，a取1-6；进一步地，式v化合物在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到式i化合物，反应式如下：所述e1为能够将式v化合物水解为式i化合物的酶；所述e2为能够将式vi化合物消旋的酶；反应过程中需添加辅酶。进一步地，l-草铵膦的制备方法，包括式iv化合物在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到式ii化合物，反应式如下，脱保护基即得到l-草铵膦，进一步地，l-草铵膦的制备方法，r3为氢，r2为乙基或丙基或异丙基，控制反应体系的ph为5-8.5，所述辅酶为磷酸吡哆醛。进一步地，酶e1基因来源包括streptomycesramulosus、pseudomonasazotoformans、mycobacteriumtuberculosis、猪肝、candidaantartica、pseudomonaswadenswilerensis、pseudomonassp、brevundimonasdiminuta。进一步地，l-草铵膦的制备方法，酶e2基因来源包括bacillaceae、trypanosomacruzi、oenococcusoeni、amycolatopsisorientalis、streptomyceslavendulae、arthrobacternicotianae、ochrobactrumanthropi、achromobacterobae。进一步地，l-草铵膦的制备方法，酶e1和酶e2为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。进一步地，l-草铵膦的制备方法，酶e1为氨基酸序列为seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、或seqidno：9所示的蛋白质，或者是seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、或seqidno：9经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有将式v化合物水解为式i化合物活性的蛋白质，或者是seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、或seqidno：9所示的氨基酸序列具有80％以上同源性具有将式v化合物水解为式i化合物活性的蛋白质。进一步地，l-草铵膦的制备方法，酶e2为氨基酸序列为seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8或seqidno：10所示的蛋白质，或者是seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8或seqidno：10经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有将式vi化合物消旋活性的蛋白质，或与seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8或seqidno：10所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有将式vi化合物消旋活性的蛋白质。本发明的优点主要体现在如下几方面：其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；其二，本发明底物利用率高，反应条件温和，对环境友好；其三，本发明制备工艺是对传统化学合成方法的升级换代，极大地降低了成本。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。实施例11、酶e1在大肠杆菌中的表达分别选择来源于streptomycesramulosus、pseudomonasazotoformans、mycobacteriumtuberculosis、猪肝、candidaantartica、pseudomonaswadenswilerensis、pseudomonassp、brevundimonasdiminuta等的酶，多种序列，所述基因序列经密码子优化在大肠杆菌中表达，通过人工合成，克隆到表达载体pet28a中并放入表达株宿主菌e.colibl21(de3)中，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入e.colibl21(de3)菌株中；含有克隆基因的各大肠杆菌e.colibl21(de3)菌株在具有适当抗生素的lb培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含适当抗生素的tb培养基中，接种量为含卡那霉素的tb培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的iptg诱导，使iptg终浓度达到0.1mm，置于25℃下继续培养20h。分别得到氨基酸序列为seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4和seqidno：9的酶e1。2、酶e2在大肠杆菌中的表达分别选择来源于bacillaceae、trypanosomacruzi、oenococcusoeni、amycolatopsisorientalis、streptomyceslavendulae、arthrobacternicotianae、ochrobactrumanthropi、achromobacterobae等的消旋酶，多种序列，所述基因序列经密码子优化在大肠杆菌中表达，通过人工合成，克隆到表达载体pet28a中并放入表达株宿主菌e.colibl21(de3)中，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入e.colibl21(de3)菌株中；含有克隆的基因的各大肠杆菌e.colibl21(de3)菌株在具有适当抗生素的lb培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含适当抗生素的tb培养基中，接种量为含卡那霉素的tb培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的iptg诱导，使iptg终浓度达到0.1mm，置于25℃下继续培养20h。分别得到氨基酸序列为seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8和seqidno：10的酶e2。实施例2消旋的2-氨基丙酰胺在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的s-2-氨基丙酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(5ml)使用酶e1(50g湿细胞/l)、酶e2(60g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基丙酰胺(30g/l)在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(100mm，ph5.0)中进行，转化温度(37℃)，转化12h后，得到单一手性的s-2-氨基丙酸。衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：586.1％84.9％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：689.3％88.4％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：781.1％82.1％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：878.7％82.5％实施例3消旋的2-氨基丁酸甲酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的s-2-氨基丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(5ml)使用酶e1(45g湿细胞/l)、酶e2(70g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基丁酸甲酯(30g/l)在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(100mm，ph7.0)中进行，转化温度(30℃)，转化12h后，得到单一手性的s-2-氨基丁酸。衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：593.6％88.2％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：683.2％81.6％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：781.5％82.4％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：874.9％73.6％实施例4消旋的2-氨基-4-甲基-戊酸苯甲酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的s-2-氨基-4-甲基-戊酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(10ml)使用酶e1(40g湿细胞/l)、酶e2(80g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基-4-甲基-戊酸苯甲酯(10g/l)在tris-盐酸缓冲溶液(100mm，ph7.5)中进行，转化温度(25℃)，转化12h后，得到单一手性的s-2-氨基-4-甲基-戊酸，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：589.2％79.1％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：689.8％73.2％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：778.7％75.3％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：881.5％82.8％实施例5消旋的2-氨基-3-苯基-丙酸甲酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的s-2-氨基-3-苯基-丙酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(10ml)使用酶e1(40g湿细胞/l)、酶e2(80g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基-3-苯基-丙酸甲酯(10g/l)在磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(100mm，ph7.5)中进行，转化温度(25℃)，转化12h后，得到单一手性的s-2-氨基-3-苯基-丙酸，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：588.1％89.4％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：685.9％86.8％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：789.6％88.4％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：888.5％86.7％实施例6消旋的2-氨基-3-氯-丁酸甲酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的s-2-氨基-3-氯-丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(50ml)使用酶e1(60g湿细胞/l)、酶e2(50g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基-4-甲基-戊酸甲酯(20g/l)在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(100mm，ph6.0)中进行，转化温度(28℃)，转化12h后，得到单一手性的s-2-氨基-3-氯-丁酸，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：591.6％88.1％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：688.3％85.7％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：789.8％82.4％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：886.7％86.5％实施例7消旋的2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的l-2-氨基-4-(甲氧基甲基膦酰基)-丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(50ml)使用酶e1(35g湿细胞/l)、酶e2(85g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.3mm)和消旋的2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺(50g/l)在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(100mm，ph6.5)中进行，转化温度(37℃)，转化12h后，得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，即l-草铵膦，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：597.8％94.1％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：695.3％92.6％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：793.4％91.5％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：886.9％97.4％实施例8消旋的2-氨基-4-(异丙氧基甲基膦酰基)-丁酸叔丁酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的l-2-氨基-4-(异丙氧基甲基膦酰基)-丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(100ml)使用酶e1(80g湿细胞/l)、酶e2(40g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基-4-(异丙氧基甲基膦酰基)-丁酸叔丁酯(40g/l)在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液(100mm，ph8.0)中进行，转化温度(35℃)，转化12h后，向转化液中加入浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到单一手性的l-2-氨基-4-(异丙氧基甲基膦酰基)-丁酸，化学法去保护基，得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，即l-草铵膦，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：597.8％95.7％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：693.7％92.8％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：797.9％94.6％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：893.2％92.1％实施例9消旋的2-氨基-4-(甲氧基甲基膦酰基)-丁酸甲酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的l-2-氨基-4-(甲氧基甲基膦酰基)-丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(50ml)使用酶e1(30g湿细胞/l)、酶e2(90g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.3mm)和消旋的2-氨基-4-(甲氧基甲基膦酰基)-丁酸甲酯(50g/l)在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(100mm，ph6.5)中进行，转化温度(37℃)，转化12h后，得到单一手性的l-2-氨基-4-(甲氧基甲基膦酰基)-丁酸，化学法去保护基，得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，即l-草铵膦，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：597.6％96.2％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：694.8％91.6％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：797.2％90.8％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：889.7％98.2％实施例10消旋的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酸异丙酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的l-2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(200ml)使用酶e1(90g湿细胞/l)、酶e2(60g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.2mm)和消旋的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酸异丙酯(70g/l)在tris-盐酸缓冲溶液(100mm，ph8.5)中进行，转化温度(40℃)，转化12h后，得到单一手性的l-2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酸，化学法去保护基，得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，即l-草铵膦，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：598.7％96.8％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：697.5％95.9％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：799.1％91.4％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：895.4％96.3％实施例11消旋的2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸苯甲酯在酶e1和酶e2的作用下反应制备得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸。反应式如下：酶e1和酶e2表达如实施例1所述，反应(100ml)使用酶e1(55g湿细胞/l)、酶e2(65g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.4mm)和消旋的2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸苯甲酯(60g/l)在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(100mm，ph7.0)中进行，转化温度(35℃)，转化12h后，得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1来源酶e1氨基酸序列酶e2来源酶e2氨基酸序列转化率ee值1streptomycesramulosusseqidno：1bacillaceaeseqidno：599.3％96.4％2pseudomonasazotoformansseqidno：2trypanosomacruziseqidno：696.8％93.4％3mycobacteriumtuberculosisseqidno：3ochrobactrumanthropiseqidno：796.7％98.2％4brevundimonasdiminutaseqidno：4achromobacterobaeseqidno：897.3％93.5％实施例12消旋的2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸乙酯在酶e1变体和酶e2变体的作用下反应制备得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸。反应式如下：酶e1变体和酶e2变体表达如实施例1所述，反应(50ml)在30℃下使用酶e1(70g湿细胞/l)、酶e2(45g湿细胞/l)、磷酸吡哆醛(5mm)、cocl2(0.5mm)和消旋的2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸乙酯(80g/l)在磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(100mm，ph7.5)中进行，转化温度(37℃)，转化12h后，得到单一手性的l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸乙酯，衍生检测转化率和ee值如下表所示：序号酶e1变体氨基酸序列酶e2变体氨基酸序列转化率ee值1seqidno：9seqidno：1099.7％99.5％其中，实施例12中酶e1变体为再seqidno：1基础上突变6个氨基酸所得，氨基酸序列如seqidno：9所示，酶e2变体为再seqidno：5基础上突变5个氨基酸所得，氨基酸序列如seqidno：10所示。本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。序列表<110>武汉茵茂特生物技术有限公司<120>l-草铵膦的制备方法<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>268<212>prt<213>streptomycesramulosus<400>1metargleuserargargalaalathralaseralaleuleuleuthr151015proalaleualaleupheglyalaseralaalavalargalaproarg202530ileglnalathrasptyrvalalaleuglyaspsertyrsersergly354045valglyalaglysertyraspserserserglysercyslysargser505560thrlyssertyrproalaleutrpalaalaserhisthrglythrarg65707580pheasnphethralacysserglyalaargthrglyaspvalleuala859095lysglnleuthrprovalasnserglythraspleuvalserilethr100105110ileglyglyasnaspalaglyphealaaspthrmetthrthrcysasn115120125aspglnglygluseralacysleualaargilealalysalaargala130135140tyrileglnglnthrleuproalaglnleuaspglnvaltyraspala145150155160ileaspserargalaproalaalaglnvalvalvalleuglytyrpro165170175argphetyrlysleuglyglysercysalavalglyleuserglulys180185190serargalaalaileasnalaalaalaaspaspileasnalavalthr195200205alalysa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