本发明属于生物酶催化领域，具体地说，本发明涉及一种转氨酶在制备sacubitril(ahu-377)中间体(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇中的应用。
背景技术：
lcz696是由诺华公司开发的一种新型降压药物，sacubitril(ahu-377)和valsartan一起形成了lcz696，sacubitril具有阻断威胁降低血压的2种多肽的作用机制，valsartan可改善血管舒张，刺激身体排泄钠和水，两者结合共同发挥药理作用，因而该药具有血管紧张素ⅱ受体与脑啡肽酶的双重抑制作用，临床表现出独特的作用模式，被认为能够减少衰竭心脏的应变，优于标准药物的降压作用，并获得美国fda和欧盟emea的快速通道审评资格。业界普遍认为lca696将会带来传统心衰治疗方案的革新。
sacubitril(ahu-377)结构式如下：
wo2008031567b1报道了sacubitril的制备方法，以(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇为原料，经tempo氧化成醛，再经witting反应，水解，不对称氢化，脱保护乙酯化和酰胺化合成制得sacubitril，具体反应步骤如下：
其中，(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇是其关键原料，因此(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的制备方法对sacubitril的生产至关重要。
(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的制备方法主要涉及到手性中心的构建，其主要方法有以手性化合物为原料的方法，如j.med.chem.,1995,38,1689-1700，以d-酪氨酸为原料，通过氨基保护，羧酸酯化，羟基三氟甲磺酸活化，suzuki偶联反应生成d-(n-叔丁氧羰基)联苯氨酸甲酯，具体反应步骤如下式所示。d-(n-叔丁氧羰基)联苯氨酸甲酯再经还原可以制得(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇
另外还有不对称氢化构建手性中心的方法，如wo2011035569a1，cn105330569a报道了以联苯甲醛为原料，在酸酐和碱的存在下与n-叔丁氧羰基甘氨酸发生环化反应生成恶唑酮化合物，恶唑酮化合物再经水解得到n-叔丁氧羰基联苯丙烯胺酸或酯，n-叔丁氧羰基联苯丙烯胺酸或酯再在金属催化剂下不对称氢化、再还原得到(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇。但是此方法需要用到昂贵的金属催化剂，成本较高，且重金属污染严重，不适合工业化大生产。
因此需要寻找一种生产成本低，环境友好，立体选择性高的制备(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种收率更高、环境友好、生产成本低且手性纯度更高的sacubitril(ahu-377)中间体(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的制备方法。
在本发明的第一方面，提供了转氨酶在制备(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇中的应用。
在另一优选例中，所述转氨酶选自下组：
(a)具有seqidno:3，或seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；
(b)具有与seqidno:3，或seqidno:2中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；
(c)将seqidno:3，或seqidno:2中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。
在另一优选例中，所述转氨酶的氨基酸序列如seqidno:3，或seqidno:2所示。
在另一优选例中，所述转氨酶的氨基酸序列如seqidno:3所示。
在另一优选例中，所述催化活性指所述转氨酶可催化作为底物的化合物3反应得到化合物2，其反应式如下：
本发明的第二方面，提供了一种制备(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的方法，包括步骤：
(1)配制反应体系并进行酶催化反应
所述反应体系中包括作为底物的化合物3、和转氨酶；以化合物3为底物，在转氨酶作用下，得到化合物2；
其反应式如下：
在另一优选例中，所述转氨酶选自下组：
(a)具有seqidno:3，或seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；
(b)具有与seqidno:3，或seqidno:2中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；
(c)将seqidno:3，或seqidno:2中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。
在另一优选例中，所述转氨酶的氨基酸序列如seqidno:3，或seqidno:2所示。
在另一优选例中，所述转氨酶的氨基酸序列如seqidno:3所示。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括磷酸吡哆醛、异丙胺。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，将化合物3溶于甲苯中，然后加入转氨酶酶液、磷酸吡哆醛、异丙胺进行反应。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，控制反应体系ph为7.0-10.0，优选为ph8.5-9.0。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(2)：将化合物2和boc2o反应制得(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇：
在另一优选例中，所述步骤(1)中，酶催化反应的温度为20-40℃。
本发明的第三方面，提供了一种制备sacubitril(ahu-377)的方法，其包括下述步骤：
(1)按照本发明第二方面所述的方法，制得(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇；
(2)将步骤(1)制得的(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇作为中间体进行反应，得到sacubitril(ahu-377)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现转氨酶可以用于(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的制备，在此基础上获得了一种反应条件温和、收率高、成本低的(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的制备方法。
现有(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的制备方法中收率低，环境危害严重等缺陷，因此本发明提出了一种转氨酶在制备sacubitril(ahu-377)中间体(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇中的应用。利用本发明的方法得到的(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇，手性纯度高，环境友好，生产成本低，利于工业化生产。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
转氨酶
本发明提供了转氨酶在制备sacubitril(ahu-377)中间体(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇(化合物1)中的应用。
在本发明的一个优选地实施方式中，在转氨酶催化下，将化合物3和异丙胺进行反应制化合物2：
然后将化合物2和boc2o反应制得目标化合物1：
在本发明的一个优选地实施方式中，所述转氨酶选自下组：seqidno.:3所示的酶3，seqidno.:2所示的酶2，seqidno.:1所示的酶1。
酶1的氨基酸序列如下：
酶2的氨基酸序列如下：
酶3的氨基酸序列如下：
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明涉及的酶基因序列，例如全人工合成或pcr法合成。一种优选的合成法为不对称pcr法。不对称pcr法是用不等量的一对引物，pcr扩增后产生大量的单链dna(ssdna)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在pcr反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链dna，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的pcr就会产生大量的单链dna。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
本发明的酶可以通过常规的重组dna技术进行表达或生产，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得目标酶。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明相关酶的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pet28a。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。
本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。
本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的rna或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用cacl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。
工程菌的培养和目的蛋白发酵生产
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：
(a)就温度而言，酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；
(b)就诱导期的ph值而言，诱导期ph控制在3-9；
(c)就溶氧(do)而言，do控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；
(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；
(e)就诱导期iptg浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常iptg浓度控制在0.1-1.5mm；
(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。
本发明的目的酶存在大肠杆菌细胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：
1.阴离子交换层析：
阴离子交换层析介质包括(但不限于)：q-sepharose、deae-sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或ph的梯度洗脱。
2.疏水层析：
疏水层析介质包括(但不限于)：phenyl-sepharose、butyl-sepharose、octyle-sepharose。样品通过添加nacl、(nh4)2so4等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3.凝胶过滤层析
疏水层析介质包括(但不限于)：sephacryl、superdex、sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
4.亲和层析
亲和层析介质包括(但不限于)：hitraptmheparinhpcolumns。
5.膜过滤
超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次提供了转氨酶在制备(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇中的应用，并经过大量实验、筛选获得了具有较高转化率和ee值的较佳转氨酶；
(2)提供了一种制备(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇的方法，该方法使用转氨酶进行催化，反应条件温和。
(3)本发明筛选到了具有较高活性的转氨酶用于制备(r)-2-(n-叔丁氧羰基氨基)联苯丙醇，实验结果表明获得的目标产物ee值可达99％，转化率可达约98％。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1转氨酶的制备
1.1酶基因的获取
根据ncbi检索到的转氨酶基因序列，全合成转氨酶基因，各酶的信息如下表1
表1
1.2酶菌株的构建
将酶基因酶连pet28a载体，酶切位点为ndei&hindiii，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞；菌种接种lb培养基于37℃，200rpm摇床培养，待od600至0.8左右时，取菌液加入终浓度为25％的无菌甘油编号后，置于-80℃低温冰箱保藏备用。
1.3菌株的培养及酶的表达
lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，用去离子水充分溶解后定容，121℃灭菌20min，待用；
将含有酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5mllb液体培养基中，37℃震荡培养12h，按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜lb液体培养基中，37℃震荡至od600达到0.8左右时，降温至30℃，加入iptg至其终浓度为0.1mm，诱导培养16h，培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。
1.4粗酶液的制备以及酶活的测定
将培养结束后收集到的菌体，用50mmph8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mlph8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含重组转氨酶的粗酶液。
分别称取250mg化合物3和250mg异丙胺盐，溶于水中，用盐酸调节ph8.5，充分溶解后定容至100ml，配置成反应溶液。取9ml上述反应溶液，加入1ml转氨酶粗酶液，在37℃，220rpm条件下反应20min，加热至100℃终止反应。检测反应液中产物的生成。酶活定义为：在37℃反应体系中，1min内能转化生成1ug产物的酶量，定义为1u。
实施例2化合物5的合成
根据专利wo2017098430a1中的方法制得化合物5。
实施例3化合物4的合成
化合物5(40g)溶于200ml二氯甲烷中，降温至-5℃，滴加含磺酰氯(21g,1.05eq)的二氯甲烷溶液(40ml)，滴完后保温反应4h。水洗后浓缩得化合物4。
实施例4化合物3的合成
化合物4(30g)溶于120ml四氢呋喃中，加入氢氧化钠水溶液(30％，27g)，室温下搅拌反应8h，加热至回流反应2h，降温后浓缩除去四氢呋喃，过滤，柱层析得化合物3。
实施例5化合物2的合成
实施例3得到的化合物3溶于100ml甲苯中，加入300ml实施例1获得的转氨酶酶液，20mm磷酸吡哆醛5ml，异丙胺12g，控制ph8.5-9.0，40℃反应16h。浓缩除去甲苯，加热至100℃使蛋白变性，过滤后滤饼用乙酸乙酯打浆2次，水相用乙酸乙酯萃取1次，合并有机相后减压浓缩，柱层析得化合物2。
实施例6化合物1的合成
化合物2(10g)分散至100ml水中，加入20ml乙醇，滴加boc2o(1.05eq，g)，氢氧化钠水溶液控制ph9-10，滴完后40℃反应2h，tlc显示反应完全，浓缩除去乙醇后，乙酸乙酯(50ml*2)萃取，浓缩除去溶剂后得11.9g产品。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>台州保灵药业有限公司
<120>转氨酶在制备sacubitril中间体中的应用
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<160>3
<170>patentinversion3.5
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<213>曲霉菌（aspergillusterreus）
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<213>尖孢镰刀菌（fusariumoxysporum）
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