一株猪圆环病毒2型病毒毒株及其应用的制作方法

本发明涉及病原微生物领域，属于兽用生物制品领域，涉及一种猪圆环病毒2型病毒毒株的分离鉴定及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术：

猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)是目前已发现的最小的动物病毒，是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员之一。根据其抗原性、核苷酸序列及致病性，可将其分成两个基因型(genotype)：1型和2型，即pcv1和pcv2。其中pcv1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，而pcv2则是目前对世界养猪业危害极大的病原体之一，给全球的养殖业带来了巨大的经济损失，可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)、仔猪先天性震颤、猪皮炎和肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome，pdns)、猪呼吸疾病综合征(porcinerespiratorydiseasecomplex，prdc)、母猪繁殖障碍和肠道疾病，总称为猪圆环病毒病(porcinecircovirusdiseases,pcvds)，研究表明pcv2在猪的淋巴系统增殖，可引起免疫细胞的凋亡，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，从而诱发多种细菌病毒的混合感染和继发感染，给养殖业造成巨大的经济损失。

pcv为无囊膜，单股环状dna病毒，成熟的病毒粒子由60个核衣壳蛋白质(cap)亚基组装成一个直径为17～20nm的正二十面体的球形颗粒，分子量为580kda，沉降系数为52s，病毒的基因组包裹其中，全长约1760bp，含有11个阅读框(orfs)，具有与滚环复制(rolling-circlereplication，rcr)相关的颈环结构，含有两个主要的开放阅读框(openreadingframe，orfs)：orf1和orf2，分别编码病毒复制相关蛋白(rep)和衣壳蛋白(cap)。rep的氨基酸同源性较高(314aa，约36kda)，cap蛋白(233aa，约27kda)是其唯一的结构蛋白和主要抗原，能诱导机体产生有效的免疫保护反应。pcv2体外培养时，可在pk-15细胞和猪源的免疫细胞中复制，但均不产生细胞病变(cytopathiceffect，cpe)。

目前，在我国已报道的pcv2基因亚型有pcv2a、pcv2b、pcv2c和pcv2d四种。2000年以前主要流行pcv2a基因型，2000年后，流行毒株由pcv2a基因型向pcv2b基因型过渡，且pcv2b基因型毒株数量逐渐增加；2009年后，pcv2d基因型逐渐增多，且序列差异较大；pcv2c报道数量较少。将近年分离毒株序列与参考分型毒株序列进行比对分析，结果显示，2017-2018年主要流行的依然是2b、2d基因亚型，且2d基因亚型占主导。因此考虑参考2d基因亚型流行株开发相应灭活疫苗，以对流行毒株进行防控。

技术实现要素：

本发明目的之一是提供一株新分离的猪圆环病毒(porcinecirovirus2，pcv2)病毒流行毒株，基因亚型为2d。

本发明的另一目的是针对现有猪圆环病毒生物制品的不足，提供一种有效安全的猪用pcv2疫苗以及该灭活疫苗的制备方法。

该灭活疫苗所采用的制备方法简单安全，疫苗免疫效果良好。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供一株猪圆环病毒2型(porcinecirovirus2，pcv2)病毒，该病毒分离自猪，名称为猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291。国际病毒分类委员会将其分类为：porcinecircovirus，pcv，属于圆环病毒科圆环病毒属，猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)，或猪圆环病毒2型(porcinecirovirus2，pcv2)。本发明的猪圆环病毒2型(porcinecirovirus2)zm-pcv2-13cgmccno.17291株分离自福建省内发生猪圆环2型病毒感染的猪场。已于2019年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.17291。

上述猪圆环病毒2型的分离培养方法，具体步骤如下：

采集猪圆环病毒2型感染患猪淋巴结样品，剪碎后用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的无菌pbs制成1:5的悬液，研磨，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000g离心10min，上清用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；

将1×10⁶个pk-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用pbs洗涤两次；将1ml过滤的猪圆环病毒2型处理液接种pk-15细胞，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％co2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2ml含有2％胎牛血清的dmem维持液，37℃培养24h，用300mm的d-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃培养48h，继续传代3次，传至第3代后，进行间接免疫荧光试验(ifa)验证。

间接免疫荧光试验(ifa)验证方法为：

将分离病毒液接种于96孔细胞板pk15细胞单层，2孔/样品，200μl/孔，同时设定空白细胞对照，在5％co2、、37℃培养24h，用300mm的d-氨基葡萄糖处理，继续培养48h；弃去维持液，用pbs缓冲液(0.01mph7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，150μl/孔，4℃固定30分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用pbs缓冲液洗涤1次；加入1:300稀释的pcv2抗体，50μl/孔，37℃孵育1h；移去孔内液体，用pbs缓冲液洗涤5次；加入1:200稀释的fitc标记兔抗猪二抗，50μl/孔，37℃孵育1h；移去孔内液体，用pbs缓冲液洗涤5次；于荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光出现，而病毒接种细胞孔细胞胞浆内应有大量绿色荧光物质着染。见图1，图1中，阳性结果为分离的猪圆环病毒2型病毒的结果。

本发明还提供了上述病毒的疫苗制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1)病毒培养：将猪圆环病毒zm-pcv2-13cgmccno.17291接种至pk-15细胞进行培养，收获病毒培养物；

2)病毒培养物的灭活，病毒培养物经反复冻融三次，离心，收取上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；

3)按比例混合灭活的猪圆环病毒2型病毒液和佐剂，乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗。

根据上述疫苗组合物的制备方法，其中步骤1)的具体过程为：用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的低糖dmem培养基，37℃、5％co2培养箱贴壁培养pk-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，接种猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291株，然后用含有2％胎牛血清、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素的低糖dmem培养基，37℃、5％co2培养24h，用300mm的d-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃继续培养48h，收获病毒培养物；

步骤2)所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/l，灭活条件为30℃灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。灭活效果接种pk-15盲传3代未出现病变为灭活合格。

步骤3)所述的佐剂为isa206或isa201，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。

本发明的积极有益效果：

本发明分离的猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291株是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。

本发明的疫苗组合物有良好的免疫原性，免疫后能够诱导动物产生较强的中和抗体，对相应毒株攻毒有较高的保护率。由于该病毒为目前流行的pcv2d亚型新毒株，该疫苗组合物具备了较强的产品竞争优势，可有效的预防pcv2在猪群中的流行与传播，降低该病造成的经济损失，具有广阔的应用前景。

本发明的疫苗所采用的制备方法快速、简单、安全。

附图说明

图1为猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291ifa免疫荧光图片(阳性和阴性)。

图2为组织病料中猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291的dna的pcr图；图2中，泳道1为猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291的dna，泳道2为阴性结果，泳道m为分子量marker。

图3为猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291特异性目的片段。泳道1和泳道2为阴性结果，泳道3为猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291的特异性片段，泳道m为分子量marker。

具体实施方式

实施例1：猪圆环病毒2型zm-pcv2-13cgmccno.17291的分离鉴定。

1.1实验材料

实验中所用的病料样本来源于福建省内发生猪圆环病的猪场，采集时间为2017年10月；猪肾细胞系(porcinekidney，pk-15)购自美国菌种中心atcc。

1.2引物设计

参照genbank中发表的pcv2mf616427.1基因系列，使用primier5设计了2对特异性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述特异性引物的核苷酸序列如下：

pcv2-f-1:5′-accagcgcacttcggcag-3′；

pcv2-r-1:5′-aatacttacagcgcacttc-3′；

pcv2-f-2：5′-tcacttagggttaagtgg-3′；

pcv2-r-2：5′-aatggcatcttcaacacc-3′；

1.3病料的采集与处理

采集患猪圆环病的淋巴结样本，剪碎后用含有100u/ml青霉素、100g/ml链霉素的无菌pbs制成1:5的悬液，使用研钵研磨至匀浆，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000×g离心10min留取上清，用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；

1.4组织病料中pcv的dna检测

用商品化的dna提取试剂盒提取dna，按产品说明书进行操作。

pcr扩增总反应体系25μl，其中含上游引物pcv2-f-11μl，下游引物pcv2-r-11μl，pcr酶mix12.5μl，无菌蒸馏水9.5μl，模板dna1μl。循环反应参数：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共34个循环；最后72℃延伸10分钟。

pcr产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测(结果见图2)。由图2可见，扩增出一条约1700bp的条带，与预期扩增片段大小相符。

将上述pcr产物用胶回收纯化试剂盒回收目的片段，克隆至pmd-18t载体上，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。序列如列表中序列1所示，测序结果通过手工校对、序列拼接，并利用blast程序在ncbi数据库中进行相似性比对，发现该段序列基因与pcv2d已知序列同源性最高，存在95～98％的相似性，结果证实该病料中pcv2核酸阳性。

1.5病毒的分离与培养

将1×10⁶个pk-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用pbs洗涤两次；将步骤1.3中冻存备用的猪圆环病毒2型病毒过滤液接种pk-15细胞，接种量为1ml，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％co2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2ml含有2％胎牛血清的dmem维持液，37℃培养24h，用300mm的d-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃培养48h，继续传代3次，传至第3代后，进行间接免疫荧光试验(ifa)验证。pcv2接种细胞孔有大量绿色荧光物质着染，阴性对照细胞应无荧光出现。

间接免疫荧光试验(ifa)验证方法为：

将分离病毒液接种于96孔细胞板pk15细胞单层，2孔/样品，200μl/孔，同时设定空白细胞对照，在5％co2、、37℃培养24h，用300mm的d-氨基葡萄糖处理，继续培养48h；弃去维持液，用pbs缓冲液(0.01mph7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，150μl/孔，4℃固定30分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用pbs缓冲液洗涤1次；加入1:300稀释的pcv2抗体，50μl/孔，37℃孵育1h；移去孔内液体，用pbs缓冲液洗涤5次；加入1:200稀释的fitc标记兔抗猪二抗，50μl/孔，37℃孵育1h；移去孔内液体，用pbs缓冲液洗涤5次；于荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光出现，而病毒接种细胞孔细胞胞浆内应有大量绿色荧光物质着染。见图1，图1中，阳性结果为分离的猪圆环病毒2型病毒的结果。

同时利用猪圆环病毒2型病毒特异性引物pcv2-f-2和pcv2-r-2对细胞培养物进行pcr扩增，pcv2接种细胞能够检测出明显的pcv2特异性目的片段(见图3)，而未接种的pk-15细胞阴性对照组未扩增出相应的核酸片段。表明该病毒已经适应pk-15细胞并且能够在该细胞上稳定增殖，分离得到一株可稳定传代的pcv2毒株。

将该毒株命名为猪圆环病毒2型zm-pcv2-13，已于2019年1月3028日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmccno.17291。

1.6动物回归试验

选择10头21～28日龄pcv2elisa抗体和pcv2抗原阴性断奶仔猪，随机分成2组，5头/组，其中第一组用猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株(10^6.0tcid50/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第二组相同方法接种细胞培养液，攻毒后所有猪均在第4、7日，肌肉注射钥匙孔血蓝蛋白(klh,sigma公司)(弗氏不完全佐剂乳化)，2mg/头，同时腹腔注射巯基乙酸培养基(sigma)，10ml/头；攻毒后第11、19日腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后临床观察25日，期间可见攻毒组仔猪全部出现少食、皮肤发绀、3-5天连续体温升高现象；血清病毒载量检测表明pcv2病毒载量明显升高。攻毒25日后将所有猪进行剖检，可见攻毒组猪出现多处淋巴结和脾脏存在充血、肿胀等现象，肺脏存在不同程度的充血、肉变、水肿等现象，肾脏发黄且存在出血点或坏死灶等现象。具体情况见表1。

表1猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株动物回归试验结果

实施例2：猪圆环病毒2型病毒株zm-pcv2-13病毒滴度的测定

将分离的病毒液接种于pk15-b1细胞单层，37℃吸附30分钟，加入含2％犊牛血清的dmem细胞维持液，37℃培养48h，继续传代至第25代，-20℃保存。用dmem细胞维持液对pcv2作10^-1～10^-8连续稀释，接种于96孔板pk15-b1细胞单层，每个稀释度接种4个孔，每孔接种100μl。同时设立阴性对照，放入co2温箱中37℃培养12h，用300mm的d-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃继续培养48h。无水乙醇固定细胞，用ifa法测定每个稀释度含有绿色荧光物质细胞的孔数，最后按reed-muench法计算病毒的tcid50。结果表明猪圆环病毒2型病毒zm-pcv2-13株的毒价为10^6.5tcid50/ml。

实施例3：猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗的制备

3.1病毒培养

用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素的低糖dmem培养基，t225cm²细胞培养瓶，37℃、5％co2培养箱贴壁培养pk-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，接种猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株，然后用含有2％胎牛血清、100u/ml青霉素、100g/ml链霉素的低糖dmem培养基，37℃、5％co2培养12h，用300mm的d-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃继续培养48h，收获病毒培养物；反复冻融3次，10000×g离心10min，去除细胞碎片，收取上清，得到猪圆环病毒2型病毒液，置于-80℃，备用。

3.2病毒液的灭活及灭活检验

在病毒含量合格的病毒液中(优选≥10^6.0tcid50/ml)加入灭活剂二乙烯亚胺，使二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/l，置于30℃恒温摇床，80rpm，灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。将1×10⁶个pk-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用pbs洗涤两次；将灭活后的病毒液用维持液做10倍稀释，接种量为500μl，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％co2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2ml维持液，继续培养4～5d，每天观察细胞状态。盲传3代，对每一代细胞培养物提取样品dna，按照步骤1.4进行pcr检测细胞中猪圆环病毒2型病毒核酸。如果结果均为阴性，表明病毒液灭活完全。按照步骤1.5进行ifa检测，有绿色荧光判为阳性，无绿色荧光判为阴性。如果结果均为阴性，表明病毒液灭活完全。

3.3制备含圆环病毒2型病毒zm-pcv2-13株的疫苗组合物

将灭活完全的zm-pcv2-13株病毒液与isa206佐剂按照体积比1:1混合，将油相和水相进行乳化，条件为30℃恒温摇床，120rpm，15min。待混合完全后，即得疫苗组合物，疫苗乳化质量能够达到国家规定的质量标准。

实施例4：圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗的免疫原性试验

4.1圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗免疫情况

通过实施例1的步骤1.4的方法和商品化猪圆环elisa抗体检测试剂盒对5～6周龄仔猪进行抗原抗体阴性筛选，选取10头抗原抗体阴性仔猪进行圆环病毒2型病毒zm-pcv2-13株灭活疫苗的免疫原性评价试验。分组情况：随机选取5头仔猪免疫圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗，每头1ml实施例3制备的疫苗组合物；对照组5头，每头颈部肌肉注射pbs1ml。免疫第0～7d每天测定体温；连续14d观察猪群食欲、精神状态；观察、触摸注射部位局部是否存在肿块。

猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗免疫仔猪后没有出现明显的体温升高现象(表2)，且猪群采食正常、精神状态良好；疫苗注射部位在免疫后5d触摸无痛感，无肿块。说明该疫苗对免疫仔猪安全性良好。

表2灭活疫苗免疫后动物体温监测表

4.2圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗诱导抗体的测定

为评估zm-pcv2-13株灭活疫苗免疫效果，在免疫后14、21、28、35d采集血清，利用商品化elisa试剂盒和中和试验检测评价血清中猪圆环病毒elisa抗体和中和抗体产生状态，评估zm-pcv2-13株灭活疫苗的免疫原性。

4.2.1按照商品化elisa试剂盒说明书进行检测elisa抗体，检测结果可见疫苗免疫后14日，即可检测到pcv2抗体；之后抗体水平逐渐升高，首免后35日，免疫组elisa抗体算术平均效价达1:3840，对照组未检出抗体，结果见表3。

表3猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株诱导仔猪产生抗体的动态变化

4.2.2为进一步评估zm-pcv2-13株灭活疫苗诱导仔猪产生抗体的效价，利用中和试验技术检测该灭活疫苗诱导免疫仔猪产生抗体水平。具体步骤如下：

1)待检血清56℃加热30分钟，10000r/min离心5分钟，小心吸出上清，用10％的dmem培养基做1:4稀释后进行2倍比稀释。

2)分别与等量1000tcid50pcv2zm-pcv2-13株病毒液混合，37℃孵育1小时，接种于含pk15-b1细胞单层的96孔板内，100μl/孔，每一稀释度平行接种4孔，同时设细胞对照孔(只加100μl/孔的10％dmem培养基)和病毒对照孔(只加100μl/孔的1000tcid50pcv2病毒液)。

3)37℃，5％co2的恒温培养箱培养24小时，用含2mmol/l的d-氨基葡萄糖盐酸的mem维持液处理，再继续培养24小时。

4)无水乙醇固定细胞，50μl/孔。

5)用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数，细胞对照孔无荧光、病毒对照孔有荧光，试验成立。

6)相比病毒对照孔，以能够减少50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。

测定血清中和抗体效价后对数据进行整理，结果见表4。由表4可见，实施例3制备的zm-pcv2-13株灭活疫苗组合物免疫14d后能够诱导免疫仔猪产生特异性抗体，基本达到免疫要求；35d抗体持续升高，最高抗体能够达到1:28.8。而对照组未检测到针对猪圆环病毒2型病毒的中和抗体(表4)。

表4猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株诱导仔猪产生中和抗体的动态变化

实施例5：圆环病毒2型zm-pcv2-13株灭活疫苗的攻毒保护试验

选择25头28～35日龄pcv2elisa抗体和pcv2抗原阴性断奶仔猪，随机分成5组，5头/组，第1～3组为免疫组，其中第1组颈部肌肉注射实施例3制备的zm-pcv2-13株灭活疫苗组合物0.5ml，第2组和第3组相同方式分别免疫1ml和2ml，第4组为攻毒对照组，免疫1mlpbs，第5组为空白对照组，不免疫不攻毒。免疫2周后，用猪圆环病毒2型zm-pcv2-13(10^6.0tcid50/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml。攻毒后于5、15和25日分别采血，分离血清，采用q-pcr方法测定病毒血症。攻毒后第25天宰杀，观察病理变化。

5.1临床症状观察及病理变化观察

结果见表5。攻毒后观察25天，疫苗组三个剂量灭活苗免疫猪均未见到明显临床表现，只有个别猪出现一过性体温升高(≥40℃)，持续2～3天后恢复正常；攻毒对照组猪pcv2攻击后第7～15天，4头猪出现体温升高40.1～40.6℃，持续3天以上，其中4头猪被毛杂乱，食欲稍减退，持续4天后恢复正常。经剖检检测表明，攻毒对照组5/5猪表现有淋巴结肿胀或出血，4/5猪肺脏出血，3/5猪出现脾脏出血，综合临床症状判为80％发病。第2组和第3组免疫后无明显异常临床症状，第2组1/5猪淋巴结组织肿大出血，综合临床症状，分别判为80％和100％保护；第1组疫苗中有2/5头猪淋巴结组织中出现淋巴肿胀，综合临床症状判为60％保护。空白对照组淋巴结组织均无明显异常，综合临床症状判为无发病。

表5猪圆环病毒2型zm-pcv2-13株疫苗免疫攻毒后临床症状和病理变化

5.2攻毒后pcv2病毒血症检测

攻毒后第5、15和25日采集血清，提取dna用pcr方法检测pcv2，结果为：空白对照猪pcr始终未检测到病毒；攻毒后不同时间检测病毒拷贝数，疫苗免疫组之间无显著差异(p>0.05)，但与攻毒对照组差异显著(p<0.05)。且在攻毒后5～25日，免疫组病毒拷贝数增长不明显，而攻毒对照组病毒拷贝数随时间显著增长。表明3组疫苗免疫后可以减少病毒的复制。结果见表6。

表6攻毒后不同时间血清中pcv2real-timepcr检测结果

注：同一时间不同字母(a，b,c,d,e,f)表示不同组别之间差异显著(p<0.05)。

证明了本发明的猪圆环病毒2型病毒疫苗组合物能够很好的保护动物不受猪圆环病毒2型病毒的攻击，此数据为该灭活疫苗的临床使用奠定了一定的理论及实践基础。

序列表

<110>中牧实业股份有限公司

<120>一株猪圆环病毒2型病毒毒株及其应用

<130>whoi190018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1767

<212>dna

<213>猪圆环病毒(porcinecirovirus)

<400>1

accagcgcacttcggcagcggcagcacctcggcagcacctcagcagcaacatgcccagca60

agaagagtggaagaagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatc120

cttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattatttta180

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atggttaccatggtgaagaagtggttgttattgatgacttttatggctggctgccgtggg720

atgatctactgagactctgtgatcgatatcctttgactgttgagactaaaggtggaactg780

taccttttttggcccgcagtattctgattaccagcaatcagaccccgttggaatggtact840

cctcaactgctgtcccagctgtagaagctctctatcggaggattacttccttggtatttt900

ggaagaatgctacagaacaatccacggaggaagggggccagttcgtcaccctttcccccc960

catgccctgaatttccatatgaaataaattactgagtcttttttatcacttcgtaatggt1020

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