用于发酵生产1,5-戊二胺的重组DNA、菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用。

背景技术：

通过dna重组技术改造具有生产l-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化生产。这些细菌的l-赖氨酸生产率的提高是通过过表达l-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。赖氨酸脱羧酶可以将l-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和co2。例如，在大肠杆菌(e.coli)中，尸胺是通过两种赖氨酸脱羧酶多肽cada和ldcc直接从l-赖氨酸生物合成的。

目前，1,5-戊二胺的生物合成主要利用两种策略进行：发酵生产或体外酶催化。在l-赖氨酸的发酵生产路径中，将赖氨酸脱羧酶(通常为cada或ldcc)，添加至产赖氨酸的微生物(例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌)中，以便将赖氨酸生物合成途径延长至1,5-戊二胺生物合成途径。或者，对于体外酶催化，可以将细菌工程化或诱导以产生赖氨酸脱羧酶(通常为cada或ldcc)，然后其可用于通过脱羧作用将赖氨酸转化为1,5-戊二胺。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以与二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。

但是，目前l-赖氨酸延长发酵生产1,5-戊二胺的路径中，1,5-戊二胺产量有限且收率较低。因此，亟需开发一种具有较高收率的生产尸胺的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供l-赖氨酸透性酶基因在微生物发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

本发明的另一目的是提供用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用。

本发明构思如下：在大肠杆菌中，l-赖氨酸透性酶lysp和膜上整合的ph感应器cadc，共同诱导l-赖氨酸依赖的菌株在酸性压力条件下的适应性。由lysp基因编码的l-赖氨酸透性酶(l-lysinepermease，lysp)是将细胞外l-赖氨酸转运至细胞内的专一的通透酶。本发明通过增加l-赖氨酸转运蛋白lysp的含量，加速l-赖氨酸向细胞内的运输过程，改善菌株对高浓度l-赖氨酸的耐受能力，促进l-赖氨酸的生产，进而提高代谢产物1,5-戊二胺的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供l-赖氨酸透性酶基因在微生物发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

本发明中，所述l-赖氨酸透性酶基因，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

本发明所述l-赖氨酸透性酶(l-赖氨酸转运蛋白)来自于微生物；优选来自大肠杆菌(escherichiacoli)、沙门氏菌属(salmonella)、绿脓假单胞菌(pesudomonaspyocyaneum)、乳球菌属(lactococcus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。

不同微生物来源的l-赖氨酸透性酶的氨基酸序列相似性比对结果见图1。

第二方面，本发明提供用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna，所述重组dna至少包括l-赖氨酸透性酶基因，以及1,5-戊二胺生物合成途径的相关基因和/或反馈抑制脱敏的相关基因。所述基因可以由相同质粒或不同质粒携带。某些基因可以由相同质粒携带。当使用两种或两种以上质粒时，优选使用具有稳定的分配系统的质粒，该系统使得这些质粒能在细胞中稳定的共存。导入所述基因的顺序没有特别限制。

优选地，所述重组dna至少包括l-赖氨酸透性酶基因和l-赖氨酸脱羧酶基因。

更优选地，所述l-赖氨酸透性酶基因是来自大肠杆菌的lysp基因(seqidno:1)或lysp基因的片段，所述l-赖氨酸脱羧酶基因是来自大肠杆菌的cada基因或ldcc基因。所述l-赖氨酸透性酶还可以是上述来源的l-赖氨酸透性酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。大肠杆菌l-赖氨酸透性酶lysp的氨基酸序列见seqidno:2。

第三方面，本发明提供含有所述重组dna的生物材料，所述生物材料包括但不限于表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供一种表达载体，包含l-赖氨酸透性酶基因和l-赖氨酸脱羧酶基因，以及能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒。

优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌(escherichiacoli)、嗜热菌(thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌的细胞。

优选地，所述骨架质粒选自puc18、puc19、pbr322、pacyc、pet、psc101以及它们的衍生质粒。

优选地，所述表达载体含有启动子、cada、lysp的dna序列或含有启动子、ldcc、lysp的dna序列。

更优选地，所述表达质粒载体包含启动子-cada-启动子-lysp、启动子-ldcc-启动子-lysp、启动子-lysp-启动子-cada或启动子-lysp-启动子-ldcc的dna序列。

第五方面，本发明提供高产1,5-戊二胺的工程菌，其包含所述重组dna，且所述工程菌的出发菌株为具有生产l-赖氨酸能力的菌株。

优选地，所述出发菌株选自埃希氏菌属(escherichia)、棒杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、哈夫尼菌属(hafnia)中的菌种。

更优选地，所述出发菌株选自大肠杆菌(escherichiacoli)、嗜热菌(thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。

在本发明的一个具体实施方式中，所述出发菌株为大肠杆菌(escherichiacoli)m11-a3，保藏编号为cctccno:m2018456。其是以大肠杆菌mg1655(e.colimg1655k12)为出发菌株，通过artp物理诱变获得的l-赖氨酸生产水平提高的突变株m11-a3。根据布达佩斯条约，大肠杆菌(escherichiacoli)m11-a3现已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctccno:m2018456，保藏日期2018年7月6日。

所述工程菌中包含：启动子-cada-启动子-lysp的dna序列或启动子-ldcc-启动子-lysp的dna序列。

其中，所述启动子选自plac、trp、tac、trc或pl等。

优选地，所述工程菌中包含：plac-cada-plac-lysp的dna序列plac-ldcc-plac-lysp的dna序列。

第六方面，本发明提供所述工程菌在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

第七方面，本发明提供1,5-戊二胺的生产方法，包括在发酵培养基中对高产1,5-戊二胺的工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供了一种高效生产1,5-戊二胺的方法，通过增加l-赖氨酸转运蛋白lysp的含量，加速l-赖氨酸向细胞内的运输过程，改善菌株对高浓度l-赖氨酸的耐受能力，同时促进l-赖氨酸的生产，进而提高代谢产物1,5-戊二胺的产量。

附图说明

图1为本发明几种微生物来源的l-赖氨酸透性酶的氨基酸序列相似性比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。

实施例1诱变获得的l-赖氨酸生产水平提高的突变株

从大肠杆菌mg1655(e.colimg1655k12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)出发，通过artp物理诱变的方法，以及l-赖氨酸类似物添加平板进行筛选。

接种mg1655菌株至50ml的lb培养基，待菌体浓度到od600＝0.6时，收集菌体。将菌体转移至artp仪器(无锡源清天木生物科技有限公司)，选取70秒进行诱变处理(致死率达到98％)，收集诱变后的菌体，稀释10²和10³倍后，全部涂板m9培养基(其中培养基中添加4mg/l的l-赖氨酸类似物aec)。在未添加aec(5-(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸)的平板上分别涂布未诱变菌(稀释10⁵倍的菌液)，以及诱变处理后的菌体(稀释10³倍的菌液)。37℃培养两天后，共获得l-赖氨酸类似物耐受能力提高的菌株36株。挑取单菌落至30μl无菌生理盐水中，从筛选平板上蘸取菌体获得浑浊的菌液。取3μl划线至不同浓度的aec平板进行复筛。通过使用不断增加浓度的l-赖氨酸类似物的添加平板继续重复筛选。最后确认m11菌株耐受能力最强。

从新突变株m11出发，通过artp物理诱变和高浓度l-赖氨酸类似物添加平板进行筛选，共获得24株新的突变菌株。将获得的24个新突变株和出发株m11，分别接种于不含抗生素的5ml种子培养基[(含有4％葡萄糖,0.1％kh2po4,0.1％mgso4,1.6％(nh4)2so4,0.001％feso4,0.001％mnso4,0.2％酵母提取物(购自英格兰oxoidltd.)，0.01％l-苏氨酸,0.005％l-异亮氨酸)]进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/l葡萄糖、0.7％ca(hco3)2和100μg/ml氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃、170rpm继续培养72h，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸的含量(表1)。

表1核磁检测24株新突变株与出发菌株m11相比的赖氨酸产量及od600

注：d25表示发酵液稀释25倍之后的测定结果。

如表1所示，发酵72h后，突变株m11-a3的赖氨酸的产量为3.57g/kg，相比于出发株m11的l-赖氨酸产量提升26％，且突变株与对照相比生长无显著差异。为提高筛选条件，将发酵时间缩短为48h。三次重复发酵出发株和该突变株，确认突变株m11-a3的产量为3.00g/kg，相对l-赖氨酸产量提升维持在24～26％。m11-a3菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2018456。

实施例2构建表达载体puc18-plac-cada、puc18-plac-ldcc、puc18-plac-cada-plac-lysp和puc18-plac-ldcc-plac-lysp

首先，构建重组表达质粒puc18-plac-cada和puc18-plac-ldcc。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入与puc18载体hindiii单酶切后上游重合20～30bp的dna序列(seqidno：3)获得引物plac-f(seqidno：4)。在cada基因序列的两端引入与plac序列及载体hindiii单酶切后下游重合20～30bp的dna序列(seqidno：6)和(seqidno：7)获得引物对cada-f/r(seqidno：8和9)。在ldcc基因序列的两端引入与plac序列及载体hindiii单酶切后下游重合20～30bp的dna序列(seqidno：10)和(seqidno：11)获得引物对ldcc-f/r(seqidno：12和13)。以puc18质粒dna作为模板，使用引物对plac-f/rseqidno：4)和(seqidno：5)，通过pcr扩增获得plac片段(seqidno：14)。以mg1655的基因组dna作为模板，分别使用引物对cada-f/r和ldcc-f/r，通过pcr扩增获得cada片段(seqidno：15)和ldcc片段(seqidno：16)。将plac、cada片段、ldcc片段和hindiii单酶切后的puc18载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将plac、cada(或ldcc)片段和载体进行重组。重组后的混合物分别转化至e.colijm109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的lb平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落pcr和测序验证证实plac-cada和plac-ldcc表达序列已分别插入到质粒载体puc18的hindiii位点，得到正确的表达载体puc18-plac-cada和puc18-plac-ldcc。

然后，构建重组表达质粒puc18-plac-cada-plac-lysp和puc18-plac-ldcc-plac-lysp。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在lysp基因序列的两端引入与puc18-plac-cada或puc18-plac-ldcc载体saci/xbai双酶切后重合20～30bp的dna序列(seqidno：17)和(seqidno：18)，获得引物对lysp-f/r(seqidno：19和20)。以大肠杆菌mg1655基因组dna作为模板，使用引物对lysp-f/r(seqidno：19和20)，通过pcr扩增获得lysp基因片段(seqidno：21)。将lysp基因片段分别与saci和xbai酶切后的puc18-plac-cada和puc18-plac-ldcc载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将lysp基因片段分别与上述两个载体进行重组。重组后的混合物全部转化至e.colijm109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的lb平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落pcr和测序验证证实lysp基因已插入到质粒载体puc18-plac-cada和puc18-plac-ldcc的saci和xbai位点之间，得到正确的表达载体puc18-plac-cada-plac-lysp和puc18-plac-ldcc-plac-lysp。

实施例3构建1,5-戊二胺生产菌株和生产1,5-戊二胺

首先，构建l-赖氨酸生产菌株：使用实施例1筛选获得的m11-a3突变株，制备感受态。将实施例2构建得到的表达载体puc18-plac-cada、puc18-plac-ldcc、puc18-plac-cada-plac-lysp和puc18-plac-ldcc-plac-lysp分别转入受体菌m11-a3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μllb培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行pcr验证筛选正确的突变株，并甘油保种。

上述含有puc18-plac-cada、puc18-plac-ldcc、puc18-plac-cada-plac-lysp和puc18-plac-ldcc-plac-lysp质粒的突变株各选取3个转化子和出发株m11-a3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(同实施例1)平板上进行筛选。进一步地，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/l葡萄糖、0.7％ca(hco3)2和100μg/ml氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(表2)。

表2核磁检测突变株与出发菌株相比的戊二胺产量及od600

如表2所示，含有质粒puc18-plac-cada和puc18-plac-cada-plac-lysp的转化株的戊二胺的产量分别为1.47g/kg和2.07g/kg。两个转化株的l-赖氨酸转化率分别为82.5％和93.1％。含有质粒puc18-plac-ldcc和puc18-plac-ldcc-plac-lysp的转化株的戊二胺的产量分别为1.31g/kg和1.87g/kg，两个转化株的l-赖氨酸转化率分别为78.0％和91.5％，且转化株与对照相比生长无显著差异。由此分析，lysp促进胞外lysine向细胞内的运送，lysp和cada基因或ldcc基因同时过表达均能够加速l-赖氨酸高效转化为戊二胺，菌株m11-a3/puc18-plac-cada-plac-lysp和m11-a3/puc18-plac-ldcc-plac-lysp可用于戊二胺的生产。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>上海凯赛生物技术研发中心有限公司

cibt美国公司

<120>用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用

<130>khp181118795.1

<160>21

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<210>1

<211>1470

<212>dna

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>1

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atgaagttcccgcagaacgataagaaataa1470

<210>2

<211>489

<212>prt

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>2

metvalsergluthrlysthrthrglualaproglyleuargargglu

151015

leulysalaarghisleuthrmetilealaileglyglyserilegly

202530

thrglyleuphevalalaserglyalathrileserglnalaglypro

354045

glyglyalaleuleusertyrmetleuileglyleumetvaltyrphe

505560

leumetthrserleuglygluleualaalatyrmetprovalsergly

65707580

serphealathrtyrglyglnasntyrvalglugluglypheglyphe

859095

alaleuglytrpasntyrtrptyrasntrpalavalthrilealaval

100105110

aspleuvalalaalaglnleuvalmetsertrptrppheproaspthr

115120125

proglytrpiletrpseralaleupheleuglyvalilepheleuleu

130135140

asntyrileservalargglypheglyglualaglutyrtrppheser

145150155160

leuilelysvalthrthrvalilevalpheileilevalglyvalleu

165170175

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180185190

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195200205

glyvalalametilevalglypheserpheglnglythrgluleuile

210215220

glyilealaalaglyglusergluaspproalalysasnileproarg

225230235240

alavalargglnvalphetrpargileleuleuphetyrvalpheala

245250255

ileleuileileserleuileileprotyrthraspproserleuleu

260265270

argasnaspvallysaspileservalserprophethrleuvalphe

275280285

glnhisalaglyleuleuseralaalaalavalmetasnalavalile

290295300

leuthralavalleuseralaglyasnserglymettyralaserthr

305310315320

argmetleutyrthrleualacysaspglylysalaproargilephe

325330335

alalysleuserargglyglyvalproargasnalaleutyralathr

340345350

thrvalilealaglyleucyspheleuthrsermetpheglyasngln

355360365

thrvaltyrleutrpleuleuasnthrserglymetthrglypheile

370375380

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385390395400

valleuglnglyhisaspileasnaspleuprotyrargserglyphe

405410415

pheproleuglyproilephealapheileleucysleuileilethr

420425430

leuglyglnasntyrglualapheleulysaspthrileasptrpgly

435440445

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450455460

pheglytyrlysleuilelysglythrhisphevalargtyrserglu

465470475480

metlyspheproglnasnasplyslys

485

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tctagagtcgacctgcaggcatgcaagctt30

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggataaccgtattaccgccttt52

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<213>人工序列(artificialsequence)

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agctgtttcctgtgtgaaattgtta25

<210>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>9

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<213>人工序列(artificialsequence)

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cgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttccacttcccttgtacgagctaatt54

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

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<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

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<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

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