一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物修复技术领域，尤其涉及一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

土壤是人类最基本的生产资料，是人类赖以生存的物质基础，而当前土壤污染却和大气污染、水体污染一起成为我国三大环境污染问题。在农业生产过程中，土壤污染会导致土壤肥力下降，农作物品质及产量降低，严重阻碍农业的可持续发展。同时，有害的物质在农作物体内积聚，可通过食物链被人类食用，进而危害人类的身体健康。

重金属是指原子密度大于5g/cm³的金属元素，大约有40种，主要包括镉、汞、铅、铬、铜、锌、锰、镍等。但是，从毒性角度一般把砷、铝等也包括在内。自20世纪初期随着工业技术的迅猛发展，人类使用重金属的范围越来越广，释放到环境当中的重金属污染物也越来越多，重金属由于其滞留时间长、毒性大、难降解等特点成为土壤污染的主要污染物之一。重金属污染土壤的途径主要包括以下几点：1）化肥、农药的过度施用。农业的增产需要施用化肥和农药，而长期大量的施用化肥和农药不仅会破坏土壤结构，其中含有的重金属会直接进入土壤，造成土壤污染。2）工业污染。在工业地区，由工厂生产排放废水、废渣、废气、粉尘等可以通过地表水体径流、大气飘尘污染周围的土地、水域和大气，不断累积造成严重的污染。3）农膜技术的使用不当。农膜技术的发展一定程度上提高了作物的生产，但农膜技术的不合理运用会产生大量的残留农膜，而这些农膜通常含有重金属，并且不易降解，残留在土壤中造成土壤污染。4）交通污染。汽车排放的尾气中含有铅、镉等重金属，是公路两侧土壤重金属污染的主要来源。研究表明，与其他有机化合物的污染不同，重金属污染很难自然降解，且具有富集性，长期蓄积并破坏土壤的自净能力，使土壤成为污染物的“储存库”。在这类土地上种植农作物，重金属能被植物根系吸收，造成农作物减产或产出含重金属的“毒粮食”、“毒蔬菜”。据统计，目前我国约20%的耕地已经不同程度的被各种重金属污染，因此，解决土壤重金属污染问题紧迫而且相当重要。

原位钝化修复是指在污染土壤中施加钝化剂，改变/降低重金属的迁移性和生物有效性，以减少进入植物中的重金属含量。其在重金属污染治理中占据重要地位。原位钝化的修复技术主要包括工程治理修复、物理修复、化学修复及生物修复四种方法。而前三种方法是比较传统的治理方法，虽然在实际应用中取得了一定成效，但存在人力与财力耗费大、实施复杂、治理费用高、易引起土壤肥力降低等缺陷，不利于大规模的推广应用，因此，采取生物修复治理重金属污染成为当今全球范围内的热门课题。生物修复包括植物修复、动物修复和微生物修复，其中植物修复利用植物吸收、挥发、提取等技术，修复效果明显，但由于植物的存活受环境因子影响较大，另外，超积累植物一般生物量较小等限制了该技术的推广应用。

利用微生物进行重金属污染环境修复，效果好，不会造成二次污染，具有较好的应用前景。研究者们已经发现了许多对重金属有耐性，且能够通过富集、吸着和转化等方式改变重金属的环境化学行为，进而对控制、治理重金属污染有积极作用的微生物。目前研究较多的具有修复重金属污染功能的细菌主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属等；真菌主要有黑曲霉、黄曲霉、假丝酵母、酿酒酵母等。微生物对重金属的修复机理主要包括生物吸附和生物转化。大量研究表明，细菌和真菌细胞壁上存在羟基、羧基、巯基、氨基、醛基等活性基团，重金属离子因而能够被吸附或络合。另一方面，微生物通过氧化还原、络合配位、甲基化、去甲基化等作用对重金属离子进行转化，以降低重金属的环境毒性。总体来说，微生物是通过对环境中重金属的吸收、沉淀、固定、共价转化等，降低重金属的迁移性和有效性，从而降重金属的毒性。近年来，国内外开展了大量利用微生物来消除土壤重金属污染的研究，也取得了较大的进展。

但是，目前微生物修复技术也存在很多问题需要解决。首先适用于土壤修复的微生物菌剂大多数还处于实验室研究阶段，还不具备商品化条件。其次，市场上现有的微生物菌剂存在着对重金属耐受性不强、有效态重金属去除率不高以及对重金属污染土壤的修复能力不理想的问题。而且微生物菌剂的剂型大多为冻干粉剂和可湿性粉剂，这类剂型产品质量不稳定，保存期短，长期保存会导致有效活菌数含量降低，而且在实际应用时，微生物易受到外界环境影响而失活，或者受到土著微生物的干扰而失去竞争优势，从而导致微生物菌剂的持效期不长，影响修复效果。

技术实现要素：

针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供一种可修复重金属污染土壤的微胶囊型微生物菌剂，本发明的另一目的是提供该种微生物菌剂的制备方法，并将其应用于农田土壤的重金属污染修复，使有效态重金属的去除率达到90%以上，实现对重金属污染农田的高效修复。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂及其制备方法和应用，其特征在于，所述微生物菌剂的活性成分包括紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，其剂型为微胶囊制剂，其总活菌数为5×10¹⁰~6×10¹⁰cfu/g。

所述的微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：

1）活化培养：在无菌环境中，分别将紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的菌种从保藏状态恢复到室温状态，再将菌种按照常规方法进行摇床活化培养，制备成种子液；

2）逐级驯化培养：将上述种子液分别接种到含有重金属离子cd²⁺、hg²⁺、pb²⁺、cu²⁺、zn²⁺的驯化培养基中进行培养，定期取样测定菌液吸光度，当吸光度达到最大值后表示驯化完成，将此时的菌液转接到含有更高浓度重金属离子的驯化培养基中培养，如此连续进行5个浓度级别的驯化培养；

3）混合发酵培养：选用液体发酵罐，发酵培养基装液量为60~70%，接种驯化后的紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌种子液，其总接种量为6~10%，各微生物的接种比例为2:1:1:3:3，控制发酵温度30~35℃，转速250~300rpm，通气量1.0~1.4vvm，在此发酵条件下发酵培养36~48h；

4）菌悬液的制备：将发酵液于6000~7000rpm条件下离心8~10min，弃上清液收集菌泥，用生理盐水洗涤2-3次，将菌泥悬浮于保护剂（5%赤藓糖醇溶液）中制备成菌悬液，使活菌密度达到1×10¹¹cfu/ml以上；

5）磁场强化微胶囊的制备：选择压缩度在20~30%的fe3o4颗粒为载体，按照载体与菌悬液的比例为1:10，向菌悬液中加入载体，然后搅匀使载体吸附菌体，在37℃下干燥得到芯材；按照芯材与壁材的比例为1:5，将芯材加入到壁材中，充分混匀后得到混合液；将混合液经蠕动泵均匀进样到喷雾干燥机，控制进风温度115~125℃，喷雾压力0.18~0.22mpa，进样流量13~15ml/min，出风温度45~55℃，喷雾干燥后收集产物即得所述微胶囊制剂。

步骤1）所述的常规方法是指将紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的菌种接种于细菌基础液体培养基中，在30~35℃、160~200r/min摇床培养18~24h；将酿酒酵母的菌种接种于酵母液体培养基中，在28~32℃、140~180r/min摇床培养30~36h。

步骤2）所述的cd²⁺、hg²⁺、pb²⁺、cu²⁺、zn²⁺，其5个浓度级别设置为60mg/l、120mg/l、180mg/l、240mg/l、300mg/l。

步骤2）所述的驯化培养基的基本配方为：葡萄糖16~20g/l，蛋白胨5~10g/l，酵母膏4~6g/l，caco32.4~3.0g/l，kh2po40.5~0.9g/l，k2hpo41.8~2.2g/l，nacl0.5~0.8g/l，mgso4·7h2o0.3~0.5g/l，茉莉酸甲酯0.12~0.14mg/l，额外添加cdcl2、pb(no3)2、hgcl2，cuso4，znso4，余量为水，ph5.5~6.5。

步骤3）所述的发酵培养基的配方为：麸皮粉20~28g/l，豆饼粉27~33g/l，菌糠粉7~11g/l，caco34~5g/l，kh2po40.5~1.0g/l，k2hpo41.8~2.2g/l，nacl0.9~1.5g/l，黄腐酸1.5~2.5g/l，吐温800.8~1.2g/l，6-ba0.6~1.0mg/l，iaa1.3~1.5mg/l，余量为水，ph5.5~6.5。

步骤5）所述的fe3o4颗粒，使用前需经过磁化处理，使其表面磁感应强度达到0.3~0.6mt。

步骤5）所述壁材的制备方法为：将麦芽糊精、微晶纤维素与水按3:1:6的质量比混合，在60℃水浴中边加热边搅拌均匀，冷却后再经20~30mpa高压均质处理10min，得到复合壁材。

所述微生物菌剂的应用是将微生物菌剂直接施用于待修复的重金属污染农田土壤中，施用量为20~50g/m²，翻耕混匀后在自然条件下处理30天左右。

本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有以下显著优势：

1）本发明选取多种具有重金属污染修复功效的微生物制成复合菌剂，这些微生物对重金属的修复机理多样，不仅能对重金属吸附积累，还能够把重金属转化为稳定态，在不对环境造成二次破坏的基础上最大限度的治理重金属污染，提高了综合修复能力。

2）本发明对选取的微生物分别进行多种重金属离子的逐级驯化培养，经驯化后的每种微生物对这些重金属都具有较高的耐受性，复配制成复合菌剂后能够适应不同程度重金属污染的土壤，即使在污染较为严重的土壤中仍能保持活性并进行高效修复。

3）本发明以fe3o4颗粒作为载体吸附微生物菌体，fe3o4颗粒不仅在喷雾干燥的过程中对菌体具有保护作用，而且fe3o4颗粒经磁化处理后能产生弱磁场，可以促进微生物的生长代谢，提高微生物生长的稳定性，从而提高其对重金属的吸附和转化能力，达到提高有效态重金属去除率的目的。

4）本发明采用喷雾干燥微胶囊技术将微生物菌剂制成微胶囊剂型，通过优化保护剂、载体以及喷雾干燥条件等提高了菌体存活率和包埋率。与其它微生物菌剂的剂型相比，本发明的微胶囊制剂可以完好保存菌种的活性，解决了微生物长期保存活性下降的难题，在使用时微生物受外界环境影响较小，抗逆性好，持效期长，能够最大限度地发挥微生物对重金属的去除效果，有效态重金属去除率可达到90%以上。

5）本发明的原料与生产过程均无毒无害，可实现无污染物排放，而且原料来源广泛、价格低廉，微胶囊制备工艺简单，适合工业化批量生产，为生物修复菌剂的商品化奠定了基础。

附图说明

图1是不同保护剂对菌体存活率和包埋率的影响；

图2是不同载体与菌悬液比例对菌体存活率和包埋率的影响；

图3是不同芯材与壁材比例对菌体存活率和包埋率的影响；

图4是不同进风温度对菌体存活率和包埋率的影响；

图5是不同喷雾压力对菌体存活率和包埋率的影响。

具体实施方式

为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。

本发明实施例中所用原料或试剂，如无特殊说明，均可通过常规市售途径获得。

所用菌种：

紫云英根瘤菌，编号58262，酿酒酵母，编号098896，购买于北京百欧博伟生物技术有限公司；

荧光假单胞菌，编号21093，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

胶冻样芽孢杆菌，编号180688，蜡状芽孢杆菌，编号132551，购买于北纳创联生物科技有限公司。

所用培养基：

细菌基础液体培养基：营养肉汤培养基，配方为蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，nacl5g/l，余量为水，ph7.0；

酵母液体培养基：ypd培养基，配方为酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，余量为水，ph5.5；

驯化培养基：基本配方为葡萄糖18g/l，蛋白胨7.5g/l，酵母膏5g/l，caco32.7g/l，kh2po40.7g/l，k2hpo42.0g/l，nacl0.65g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，茉莉酸甲酯0.13mg/l，额外添加cdcl2、pb(no3)2、hgcl2，cuso4，znso4，余量为水，ph6.0；

发酵培养基：配方为麸皮粉24g/l，豆饼粉30g/l，菌糠粉9g/l，caco34.5g/l，kh2po40.75g/l，k2hpo42.0g/l，nacl1.2g/l，黄腐酸2.0g/l，吐温801.0g/l，6-ba0.8g/l，iaa1.4mg/l，余量为水，ph6.0。

实施例1

一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂，其活性成分包括紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，其总活菌数为5×10¹⁰~6×10¹⁰cfu/g，其剂型为微胶囊制剂，该微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）活化培养：在无菌环境中，分别将紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的菌种从保藏状态恢复到室温状态，将紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、胶冻样芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的菌种分别接种于营养肉汤培养基中，在33℃、180r/min摇床培养18~24h制备成种子液；将酿酒酵母的菌种接种于ypd培养基中，在30℃、160r/min摇床培养30~36h制备成种子液。

2）逐级驯化培养：将上述种子液分别接种到含有重金属离子cd²⁺、hg²⁺、pb²⁺、cu²⁺、zn²⁺的驯化培养基中进行培养，定期取样测定菌液吸光度，当吸光度达到最大值后表示驯化完成，将此时的菌液转接到含有更高浓度重金属离子的驯化培养基中培养，如此连续进行5个浓度级别的驯化培养；cd²⁺、hg²⁺、pb²⁺、cu²⁺、zn²⁺的5个浓度级别设置为60mg/l、120mg/l、180mg/l、240mg/l、300mg/l。

3）混合发酵培养：选用液体发酵罐，发酵培养基装液量为65%，接种驯化后的紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌种子液，其总接种量为6~10%，各微生物的接种比例为2:1:1:3:3，控制发酵温度33℃，转速280rpm，通气量1.2vvm，在此发酵条件下发酵培养48h。

4）菌悬液的制备：将发酵液于6000~7000rpm条件下离心8~10min，弃上清液收集菌泥，用生理盐水洗涤2-3次，将菌泥悬浮于保护剂（5%赤藓糖醇溶液）中制备成菌悬液，使活菌密度达到1×10¹¹cfu/ml以上。

5）磁场强化微胶囊的制备：选择压缩度在20~30%的fe3o4颗粒为载体，使用前需经过磁化处理，使其表面磁感应强度达到0.3~0.6mt；按照载体与菌悬液的比例为1:10，向菌悬液中加入载体，然后搅匀使载体吸附菌体，在37℃下干燥得到芯材；按照芯材与壁材的比例为1:5，将芯材加入到壁材（制备方法为：将麦芽糊精、微晶纤维素与水按3:1:6的质量比混合，在60℃水浴中边加热边搅拌均匀，冷却后再经20~30mpa高压均质处理10min）中，充分混匀后得到混合液；将混合液经蠕动泵均匀进样到喷雾干燥机，控制进风温度120℃，喷雾压力0.20mpa，进样流量14ml/min，出风温度50℃，喷雾干燥后收集产物即得微胶囊制剂。

实施例2、保护剂的优选

选择海藻糖、淀粉、赤藓糖醇、明胶、乳清粉作为保护剂，将菌泥分别悬浮于各保护剂中制备成菌悬液，再按照实施例1步骤5）中的方法制备成微胶囊制剂，计算出不同保护剂条件下的菌体存活率。

结果分析：喷雾干燥过程中，由于高温、高渗透压，容易造成菌体损伤，导致微生物死亡。通常，通过加入保护剂，能有效减少喷雾干燥过程中对菌体结构的损伤，喷雾干燥保护剂主要包括蛋白类和糖类。图1为不同保护剂条件下的菌体存活率，由图1可见，赤藓糖醇、海藻糖、乳清粉的菌体存活率较高，说明保护效果较好。而赤藓糖醇的菌体存活率最高，保护效果最好，故选择赤藓糖醇作为最适保护剂。

实施例3、载体与菌悬液比例的优选

设置载体与菌悬液的比例为变量：比例设置为1:16、1:14、1:12、1:10、1:8，其余参数条件保持不变，按照实施例1步骤5）中的方法制备成微胶囊制剂，计算出不同载体与菌悬液比例条件下的菌体存活率和包埋率。

结果分析：在喷雾干燥过程中，载体对菌体具有保护作用，然而载体吸附菌体的过程十分复杂，载体浓度过高或过低都会影响载体与菌体复合物的稳定性，从而影响菌体的存活率和包埋率。图2为不同载体与菌悬液比例条件下的菌体存活率和包埋率。由图2可见，当载体与菌悬液的比例为1:10时，其菌体存活率和包埋率最高，因此选择1:10作为载体与菌悬液的最适比例。

实施例4、芯材与壁材比例的优选

设置芯材与壁材的比例为变量：比例设置为1:1、1:3、1:5、1:7、1:9，其余参数条件保持不变，按照实施例1步骤5）中的方法制备成微胶囊制剂，计算出不同芯材与壁材比例条件下的菌体存活率和包埋率。

结果分析：壁材在微囊化过程中起着决定性作用，壁材对菌体具有保护作用，是影响菌体存活率的主要因素。图3为不同芯材与壁材比例条件下的菌体存活率和包埋率。由图3可见，随着壁材浓度的增加，菌体存活率也逐渐升高；而包埋率随着壁材浓度的增加呈先升高后降低的趋势，当壁材浓度过高时，物料的粘度较大，不利于喷雾干燥，影响包埋效率，因此综合考虑选择1:5作为芯材与壁材的最适比例。

实施例5、喷雾干燥条件的优化

1）进风温度的优化

设置喷雾干燥时的进风温度芯为变量：温度设置为80、100、120、140、160℃，其余参数条件保持不变，按照实施例1步骤5）中的方法制备成微胶囊制剂，计算出不同进风温度下的菌体存活率和包埋率。

结果分析：在喷雾干燥过程中，进风温度是主要控制因素之一，当进风温度过低时，产物的含水量増大，流动性降低并容易结块，影响包埋效率；当进风温度过高时，容易造成菌体损伤，还会降低壁材对芯材的保护作用。图4为不同出风温度条件下的菌体存活率和包埋率。由图4可见，当进风温度为120℃时，其菌体存活率和包埋率最高，因此选择120℃作为最适进风温度。

2）喷雾压力的优化

设置喷雾干燥时的喷雾压力为变量：压力设置为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mpa，其余参数条件保持不变，按照实施例1步骤5）中的方法制备成微胶囊制剂，计算出不同喷雾压力下的菌体存活率和包埋率。

结果分析：在喷雾干燥过程中，喷雾压力也是主要控制因素之一，当喷雾压力过低时，产物的粒径过大，影响水分的快速蒸发，从而影响包埋效率；当喷雾压力过高时，容易破坏菌体细胞结构，从而影响菌体存活率。图5为不同喷雾压力条件下的菌体存活率和包埋率。由图5可见，当喷雾压力为0.20mpa时，其菌体存活率和包埋率最高，因此选择0.20mpa作为最适喷雾压力。

对比例1

一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂，其活性成分包括紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，其剂型为冻干粉剂，该微生物菌剂的制备方法是按照实施例1步骤4）中的方法制备出菌悬液，在超低温冰箱中-20℃预冻5~6h后进行真空冷冻干燥，主干燥阶段-30℃，终干燥阶段-40℃，使最终冻干粉剂的含水量低于5%。

对比例2

一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂，其活性成分包括紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，其剂型为可湿性粉剂，该微生物菌剂的制备方法是按照实施例1步骤4）中的方法制备出菌悬液，将菌悬液与白炭黑按照10:1的比例混合，37℃鼓风干燥，制得可湿性粉剂。

对比例3

一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂，其活性成分包括紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，其剂型为微胶囊制剂，该微生物菌剂的制备方法与实施例1不同之处在于取消步骤2）逐级驯化培养，其它步骤与实施例1相同。

对比例4

一种可修复重金属污染土壤的微生物菌剂，其活性成分包括紫云英根瘤菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、胶冻样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，其剂型为微胶囊制剂，该微生物菌剂的制备方法与实施例1不同之处在于，在步骤5）中直接以菌悬液为芯材，按照芯材与壁材的比例为1:1，将芯材加入到壁材中，充分混匀后得到混合液；其它喷雾干燥条件与实施例1相同。

试验例1

1）制剂的热储稳定性试验

将实施例1、对比例1、对比例2的微生物菌剂置于恒温箱中，在54±2℃条件下储存14d，每隔2d计数一次，测定其菌体存活率的变化。

2）制剂的常温储存稳定性试验

将实施例1、对比例1、对比例2的微生物菌剂置于恒温箱中，在25±2℃条件下储存360d，每隔60d计数一次，测定其菌体存活率的变化。

结果分析：从制剂的热储稳定性试验结果可知，储存14d时实施例1微胶囊制剂的菌体存活率为92.20%，显著高于对比例1的冻干粉剂和对比例2的可湿性粉剂的菌体存活率；从制剂的常温储存稳定性试验结果可知，储存360d时实施例1微胶囊制剂的菌体存活率为91.08%，也显著高于对比例1的冻干粉剂和对比例2的可湿性粉剂的菌体存活率，表明微胶囊制剂具有很好的储存稳定性。

试验例2

2017年6月，试验取材于江苏省连云港市灌南县化工园区外污灌地区的农田，试验前对该农田土壤表层0~20cm取样，进行有效态重金属含量检测，检测结果为镉1.02mg/kg，汞2.76mg/kg，铅136.7mg/kg，铜80.9mg/kg，锌215.1mg/kg，土壤ph值为5.5~6.0，然后将该农田划分为5个区域，每个区域分别采用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的微生物菌剂进行修复处理，处理方法为将微生物菌剂直接施用于待修复的土壤中，施用量为30g/m²，翻耕混匀后在自然条件下处理30天左右。处理结束后再对每个区域的土壤进行有效态重金属含量进行检测，计算几种重金属的去除率，结果见表3。

试验例3

2017年9月，试验取材于江苏省句容市石砀山铜矿场周边的农田，试验前对该农田土壤表层0~20cm取样，进行有效态重金属含量检测，检测结果为镉5.95mg/kg，汞4.18mg/kg，铅58.3mg/kg，铜247.4mg/kg，锌328.6mg/kg，土壤ph值为6.5~7.0，然后将该农田划分为5个区域，每个区域分别采用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的微生物菌剂进行修复处理，处理方法为将微生物菌剂直接施用于待修复的土壤中，施用量为40g/m²，翻耕混匀后在自然条件下处理30天左右。处理结束后再对每个区域的土壤进行有效态重金属含量进行检测，计算几种重金属的去除率，结果见表4。

结果分析：从试验例2和试验例3的结果可知，使用实施例1的微生物菌剂进行修复处理，其对镉、汞、铅、铜、锌等重金属有效态的去除率均达到了90%以上，显著高于对比例1-4的去除率，表明本发明的微生物菌剂对重金属污染土壤的修复效果显著。

实施例1、对比例3和对比例4的有效态重金属去除率均高于对比例1和对比例2，这是由于实施例1、对比例3和对比例4的微生物菌剂均为微胶囊剂型，比普通粉剂能够更好地保存微生物的活性，在使用时微生物受外界环境影响较小，抗逆性好，持效期长，能够最大限度地发挥微生物对重金属的去除效果。

比较实施例1与对比例3，实施例1的微生物菌剂在制备过程中对选取的微生物分别进行多种重金属离子的逐级驯化培养，经驯化后的每种微生物对这些重金属都具有较高的耐受性，复配制成复合菌剂后能够适应不同程度重金属污染的土壤，即使在污染较为严重的土壤中仍能保持活性并进行高效修复。

比较实施例1与对比例4，实施例1的微生物菌剂在制备过程中以fe3o4颗粒作为载体吸附菌体，fe3o4颗粒不仅在喷雾干燥的过程中对菌体具有保护作用，而且fe3o4颗粒经磁化处理后能产生弱磁场，可以促进微生物的生长代谢，提高微生物生长的稳定性，从而提高其对重金属的吸附和转化能力，达到提高有效态重金属去除率的目的。

综上所述，尽管本发明通过具体实施方式对本发明进行了详细描述，但本领域一般技术人员应该明白的是，上述实施例仅仅是对本发明的优选实施例的描述，而非对本发明保护范围的限制，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。