一种双位点、高灵敏pH荧光探针及其合成与应用的制作方法

本发明涉及一种双位点、高灵敏ph荧光探针，具体涉及一种双位点、高灵敏ph荧光探针及其合成方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

细胞内ph值(phi)作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在细胞周期调控、细胞的生长与凋亡、离子转运、酶活性、钙调控、肌肉收缩和多药耐药性等细胞生理调控和病理过程中发挥着重要作用，细胞的内吞作用、吞噬作用以及受体配体的内化作用等内化通路也同样受phi的影响。phi异常会导致生物体内细胞和组织器官功能紊乱、酶和蛋白质活性受到抑制，人体的免疫力下降，最终引发疾病。此外，细胞内phi变化同时与细胞凋亡密切相关。癌细胞在细胞凋亡初期，一般会引起细胞内的酸化作用，且细胞内酸化已成为细胞凋亡的一个重要的早期特征。细胞内酸化与细胞凋亡的相互关系也引起了许多科研工作者的研究兴趣。因此，对细胞内phi进行灵敏、准确的实时原位监测，有助于从分子水平上理解细胞的生理和病理过程。

荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应时间短、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种离子及生物物种的检测或细胞荧光成像。用于检测细胞内ph值的荧光探针也得到了迅速发展，其中一些已经商品化。但是，目前报道的和已经商品化的溶酶体ph荧光探针大都是荧光增强型探针。探针分子对ph的响应信号易受探针浓度、温度、激发光强度等因素的干扰，影响检测结果。相比之下，比率型荧光探针以两个荧光信号的比值为输出信号，可有效的避免或降低这些因素的干扰。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，比率型ph荧光探针具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供一种双位点、比率型ph值探针，用于高灵敏检测细胞内ph变化。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在细胞成像中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种双位点、比率型ph值荧光探针，简称cr-ph，其化学结构式如式（i）所示：

式(i)。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）以乙醇作溶剂，加入2,4-二羟基苯甲醛和的米氏酸，加入催化剂量的吡咯烷，加热回流24小时；冷却至室温后倒入水中，用二氯甲烷萃取后干燥、蒸馏得粗产物，分离提纯可得7-羟基-2羧基香豆素；

（2）以乙醇作溶剂，将罗丹明b和的乙二胺加入烧瓶中，加热回流反应24小时；冷却至室温后倒入水中，用二氯甲烷甲烷萃取后干燥、蒸馏得粗产物，分离提纯可得2-氨乙基氨基罗丹明；

（3）以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，加入7-羟基-2羧基香豆素和的2-氨乙基氨基罗丹明，加入碳化二亚胺（edci）、4-二甲氨基吡啶（dmap）和1-羟基苯并三唑（hobt），室温搅拌至反应完成，冷却至室温后倒入水中，用二氯甲烷取后干燥、蒸馏得粗产物，分离提纯可得荧光探针。

步骤（1）、（2）、（3）中，所述分离步骤为：柱色谱分离，洗脱液为体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯。

上述荧光探针的合成路线如下：

。

一种上述荧光探针在比率成像检测细胞内ph值中的应用。蓝光激发波长为405nm，检测波段为425-475nm；红光激发波长为561nm，检测波段为570-620nm。检测时间为反应30min后。

上述荧光探针的机理如下：

本发明所述荧光探针本身无荧光，碱性条件下，香豆素部分去质子化发出蓝色荧光；酸性条件下，罗丹明开环给出红色荧光。

本发明具有以下优点：

本发明的探针合成方法简单、收率高，可实现对ph值得高灵敏、比率型检测。

附图说明

图1为化合物1的¹hnmr谱；

图2为化合物2的¹hnmr谱；

图3为荧光探针的¹hnmr谱；

图4为荧光探针的hrms谱；

图5为探针对ph值的响应光谱；

图6为探针染色普通及自噬细胞的荧光成像图片；

图7为探针的毒性测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

（1）化合物1的合成

以乙醇作溶剂，加入2,4-二羟基苯甲醛(1.38g,10mmol)和的米氏酸(1.44g,10mmol)，加入催化剂量的的吡咯烷，加热回流24小时；冷却至室温后倒入水中，用二氯甲烷萃取后干燥、蒸馏得粗产物，分离提纯可得7-羟基-2羧基香豆素；柱色谱提纯可得到纯净产物1.21g，为乳白色晶体，产率为61%。其核磁共振氢谱如图1所示。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.46(s,1h),7.64(d,j=8.6hz,1h),6.80(dd,j=8.6,2.2hz,1h),6.70(d,j=2.1hz,1h)；

（2）化合物2的合成

以乙醇作溶剂，将罗丹明b(4.79g,10mmol)和乙二胺(6ml,100mmol)加入烧瓶中，加热回流反应24小时；冷却至室温后倒入水中，用二氯甲烷甲烷萃取后干燥、蒸馏得粗产物，分离提纯可得2-氨乙基氨基罗丹明；柱色谱提纯可得到纯净产物3.01g，为乳白色晶体，产率为63%。其核磁共振氢谱如图2所示。¹hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.95-7.86(m,1h),7.52-7.41(m,2h),7.15-7.06(m,1h),6.45(d,j=8.9hz,2h),6.39(d,j=2.6hz,2h),6.29(dd,j=8.9,2.6hz,2h),3.35(q,j=7.2hz,8h),1.18(t,j=7.0hz,12h)；

（3）探针cr-ph的合成

以dmf为溶剂，加入7-羟基-2羧基香豆素(0.2g,1mmol)和2-氨乙基氨基罗丹明(0.49g,1mmol)，加入edci(0.38g,2mmol)、dmap(0.22g,2mmol)和hobt(0.27g,2mmol)。室温搅拌24小时以完成反应，冷却至室温后倒入水中，用二氯甲烷甲烷萃取后干燥、蒸馏得粗产物，分离提纯可得终产物为0.23g黄色固体，产率为41%。其核磁氢谱如图3所示。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.07(s,1h),8.66(s,1h),8.41(t,j=5.5hz,1h),7.89-7.68(m,2h),7.57-7.42(m,2h),6.99(dd,j=5.9,2.7hz,1h),6.88(dd,j=8.6,2.3hz,1h),6.79(d,j=2.2hz,1h),6.47-6.32(m,4h),6.27(dd,j=8.9,2.6hz,2h),3.19(dq,j=16.3,6.5,5.6hz,12h),1.02(t,j=7.0hz,12h)。其高分辨质谱如图4所示。

实施例2荧光探针cr-ph对ph值响应的光谱测试

称取实施例1中的荧光探针cr-ph，以二甲基亚砜（dmso）配制成5mm的母液。

分别取10μl探针母液加入5ml容量瓶中，加入不同ph值的缓冲溶液定容，摇匀后进行光谱测试，激发波长为405nm及561nm，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图5a,b。图5c为405nm激发、455nm处的荧光强度随ph值的变化；以及561nm激发、588nm处的荧光强度随ph值的变化。图5d为588nm处荧光强度与455nm处荧光强度的比值随ph值的变化。从图中可知，随着ph值的变化红光和蓝光强度以及红蓝光比值有着急剧改变，证明该探针可以高灵敏度、比率型检测ph值的变化。

实施例3荧光探针cr-ph的细胞成像研究

（1）荧光成像

将密度为3×10⁵个/ml的hela细胞接种到灭菌的35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）培养12小时以上使细胞贴壁。稀释实施例2中所述母液至1mm，向死活细胞培养皿中加入的稀释液，使其终浓度均为5μm。继续分别在相同条件下继续培养0.5h，然后将细胞培养液吸走，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，以405nm和561nm为激发波长，利用蓝、红通道成像。

（2）研究细胞自噬过程中细胞内ph值的变化

将密度为3×10⁵个/ml的hela细胞接种到灭菌的35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）培养12小时以上使细胞贴壁。稀释实施例2中所述母液至1mm，向死活细胞培养皿中加入的稀释液，使其终浓度均为5μm。继续分别在相同条件下继续培养0.5h，然后将细胞培养液吸走，加入pbs缓冲液，饥饿处理2小时诱导细胞自噬。然后以405nm和561nm为激发波长，利用蓝、红通道成像。由图6可知，细胞自噬后，细胞质ph值降低，溶酶体内ph值升高，说明探针可以成像自噬过程中的ph值变化。

实施例4探针的细胞毒性测试

将细胞密度为8000个/ml的hela细胞接种到96孔板的部分孔内，剩余孔则用无细胞的培养基填充，并在不同的条件下在co2培养箱中孵育细胞。实验组为用含5μm的cr-ph的培养基孵育2小时、12小时和24小时后的细胞样品，对照组为不加染料的含细胞样品，空白组为无细胞的培养基样品。待孵育完成后，用新鲜的培养基换掉细胞培养液，并在每个培养孔中加入10μl的mtt，再孵育细胞4小时。孵育完成后，移除培养基，每孔加入200μl的dmso，并用摇床晃动其10min以溶解甲瓒。使用酶标仪测试每个孔在440nm处的吸光度，细胞存活率可通过下述公式计算得到：

其中，asample为实验组吸光度，ac为对照组吸光度，ab为空白组的吸光度。如图7所示，染色24小时后细胞存活率仍高达94%，说明探针的毒性很低。