一种同时检测32个Y染色体基因座的复合扩增试剂盒的制作方法

本发明属于法医dna鉴定领域，尤其涉及一种同时检测32个y染色体基因座的复合扩增试剂盒。

背景技术：

短串联重复序列(shorttandemrepeats，str)，也称微卫星dna(microsatellitedna)，是由2～6个碱基作为核心基序，串联重复形成的一类dna序列，广泛分布于人类基因组中，具有多态性高、信息量大以及易于检测等优点。自上世纪90年代发现以来，现已广泛应用于法医dna鉴定、物种鉴别和遗传病诊断等领域。

y染色体str遗传标记是指存在于y染色体特异区的短串联重复序列。在减数分裂时，y染色体特异区不与x染色体进行重组交换，所以y染色体str遗传标记具有男性特有、父系单倍型遗传等特点。

目前，在法医领域，y染色体str遗传标记主要应用于家系排查和辅助个体识别。而满足上述应用的前提，则需要ystr试剂盒具有足够高的整体多态性。而增加ystr试剂盒位点数，是提高ystr试剂盒的整体多态性，增加累计非父排除率和个体识别能力的有效途径。但是在现有技术条件下，ystr试剂盒位点数的增加，具有一定的局限性。因此，当前市场上，主流的ystr建库试剂盒均是以公安部发布的20个核心ystr基因座为基础，然后再从公安部发布的优选和备选基因座中，选择10到20个基因座进行优化组合。此外，随着市场上差异化需求的不断增长，用户对于试剂盒包含的基因座数量、兼容性等提出了更高的要求。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种同时检测32个y染色体基因座的复合扩增试剂盒。本发明中的基因座是具有高多态性的基因座，其在实际应用过程中，不仅可用于家系排查，也可用于对主流建库试剂盒的功能进行补充，以满足客户的差异化需求。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种同时检测32个染色体基因座的复合扩增试剂盒，其中，包括56条扩增引物，分别依次为：seqidno:1～2、seqidno:3～4、seqidno:5～6、seqidno:7～8、seqidno:9～10、seqidno:11～12、seqidno:13～14、seqidno:15～16、seqidno:17～18、seqidno:19～20、seqidno:21～22、seqidno:23～24、seqidno:25～26、seqidno:27～28、seqidno:29～30、seqidno:31～32、seqidno:33～34、seqidno:35～36、seqidno:37～38、seqidno:39～40、seqidno:41～42、seqidno:43～44、seqidno:45～46、seqidno:47～48、seqidno:49～51、seqidno:52～53、seqidno:54～56。

在一些实施例中，所述56条扩增引物对应的y染色体基因座依次分别为：dys531、dys630、dys622、dys510、dys533、dyf404s1a/b、dys459a/b、dys446、dys443、dys388、dys587、dys522、dys626、yindel、dys460、y_gata_a10、dys520、dys557、dys527a/b、dys481、dys508、dys444、dys385a/b、dys552、dys526a/b、dys617和dys713，其中，所述dyf404s1a/b、所述dys527a/b、所述dys385a/b和所述dys526a/b为双等位基因基因座。

在一些实施例中，所述y染色体基因座所对应的引物对在扩增体系中的终浓度为0.027μm～0.82μm。

在一些实施例中，所述y染色体基因座所对应的引物对在扩增体系中的终浓度依次分别为dys531：0.52μm、dys630：0.08μm、dys622：0.82μm、dys522：0.02μm、dys460：0.78μm、y_gata_a10：0.06μm、dys520：0.8μm、dys481：0.41μm、dys444：0.76μm、dys552：0.24μm、dys526a/b：0.3μm、和dys510：0.124μm、dys533：0.021μm、dyf404s1a/b：0.144μm、dys459a/b：0.7μm、dys446：0.09μm、dys443：0.027μm、dys388：0.53μm、dys557：0.071μm、dys587：0.184μm、dys626：0.41μm、dys527a/b：0.051μm、dys508：0.14μm、dys385a/b：0.17μm、dys617：0.15μm、dys713：0.45μm和yindel：0.5μm。

在一些实施例中，所述每个基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。

在一些实施例中，所述荧光染料包括6-fam、hex、sum、lyn、pur、和/或siz。

在一些实施例中，所述每个y染色体基因座对应的扩增引物的长度为90-480bp。

一种根据上述所述的试剂盒的应用，其中，所述试剂盒用于亲权鉴定、个体识别。

与现有技术相比，本发明提供的一种同时检测32个y染色体基因座的复合扩增试剂盒，达到的技术效果是：本发明通过提供市场上未被广泛使用的新y染色体基因座位点，如dyf404s1a/b、dys626、dys508、dys713、dys617、dys526a/b等，与市场上主流建库试剂盒，如pathfinder、yfilerplatinum、dnatypertmy36、agcufsy37联用，可检测多达60个ystr基因座，以提高ystr试剂盒的整体多态性，和增加累计非父排除率和个体的识别能力，满足用户对y染色体基因座的数量和高多态性的要求。

附图说明

图1是根据本申请一些实施例所示的基因座的排布示意图；

图2是根据本申请一些实施例所示的等位基因ladder分型图；

图3是根据本申请一些实施例所示的标准dna9948的分型图；

图4是根据本申请一些实施例所示的试剂盒对棉签提取样本的分型图；

图5是根据本申请一些实施例所示的试剂盒对fta血卡样本的分型图；

图6是根据本申请一些实施例所示的试剂盒对唾液卡样本的分型图。

以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。

实施例132个y染色体基因座的筛选

在一些实施例中，y染色体基因座可以基于现有文献等记载进行获取，并对其进行筛选。在一些实施例中，可以基于获取的y染色体基因座的多态性进行调查，筛选出高多态性基因座。其中，高多态性基因座可以包括低突变的高多态性基因座，或高突变的高多态性基因座等。在一些实施例中，低突变的高多态性基因座可以指突变率低于1％，多态性高于0.6的基因座为低突变的高多态性基因座(如表1)；高突变的高多态性的基因座可以指突变率高于1％，多态性高于0.6的基因座为高突变的高多态性基因座(如表1)。

为了便于理解的目的，本实施例可以通过对dys271、dyf380s1、dys566、dys611、dyf396s1、dys441、dys67、dys11、dys66、dys551、dys282、dys564、dys507、dys148、dys507、dys712、dys559、dys512、dys385a/b、dys481、dys533、dys643、dys460、dys549、dys387s1a/b、dys449、dys518、dys627、dys570、dys527a/b、dys447、dys444、dys557、dys596、dys446、dys510、dys622、dys443、dys587、dys522、y_gata_a10、dys520、dys552、dys593、dys531、dys459a/b、dys508、dys388、dys617、dys645、dys713、dys630、dyf404s1a/b、dys626、dys526a/b等63个基因座，在中国人群中的多态性调查，优选出27个低突变、高多态性基因座：dys531、dys481、dys510、dys533、dys459a/b、dys446、dys443、dys388、dys557、dys587、dys522、dys520、dys527a/b、dys460、y_gata_a10、dys508、dys444、dys385a/b、dys552、dys526a、dys617、dys630、dys622、dys713和4个高突变、高多态性基因座：dyf404s1a/b、dys526b、dys626以及一个yindel。其中上述31个基因座(除yindel)的详细信息见表1。

表1：31个ystr基因座信息

为了进一步说明本发明优选的31个ystr基因座和一个yindel，与目前市场上主流的y建库试剂盒(如表2所示的4个试剂盒)形成较好的互补，本发明将所筛选的31个ystr基因座和一个yindel与下述4个市场上主流的y建库试剂盒中的基因座进行比较。详见表2，其中“+”指的是本发明可以识别的基因座，空格为本发明不能识别该str基因座。其中，4个市场上主流的y建库试剂盒可分别包括pathfinder、yfilerplatinum、dnatyper^tmy36、agcufsy37。

表2：本发明所提供的试剂盒与国内外试剂盒比较

实施例2：基因座排布

根据实施例1中优选的32个y染色体基因座序列及其多态性等特征，结合荧光染料的特性，可以设计独特的基因座排布方式。

在一些实施例中，荧光染料用于将每个基因座的扩增引物对中的至少一条引物5′端进行标记。

在一些实施例中，本发明可以将32个y染色体基因座分为五组：第一组：dys510、dys533、dys531、dys630、dys622、dyf404s1a/b；第二组：dys443、dys388、dys459a/b、dys446、dys557、dys587、dys522、dys626；第三组：y_gata_a10、dys460、dys527a/b、dys520、yindel；第四组：dys385a/b、dys481、dys508、dys444、dys552；第五组：dys617、dys526a/b、dys713。

在一些实施例中，本发明可以将32个y染色体基因座分为五组：第一组：dys510、dys533、dys531、dys630、dys622、dyf404s1a/b，采用蓝色荧光染料；第二组：dys443、dys388、dys459a/b、dys446、dys557、dys587、dys522、dys626，采用绿色荧光染料；第三组：y_gata_a10、dys460、dys527a/b、dys520、yindel，采用黄色荧光染料；第四组：dys385a/b、dys481、dys508、dys444、dys552，采用红色荧光染料；第五组：dys617、dys526a/b、dys713，采用紫色荧光染料。

在一些实施例中，本发明可以将32个y染色体基因座分为五组：第一组：dys510、dys531、dys622、dys630、dys533、dyf404s1a/b，蓝色荧光染料为：6-fam；第二组：dys446、dys557、dys443、dys388、dys587、dys459a/b、dys522、dys626，绿色荧光染料为：hex；第三组：y_gata_a10、dys520、dys460、dys527a/b、yindel，黄色荧光染料为：sum；第四组：dys444、dys385a/b、dys481、dys508、dys552，红色荧光染料为：lyn；第五组：dys617、dys526a/b、dys713，紫色荧光染料为pur，如图1所示，即图1为本发明的基因座排布图。

实施例3：基因座引物设计和复合扩增体系建立

引物设计时需要注意一下几点：a、避免引物间二聚体和发卡结构，以免影响引物的扩增效率；b、确保引物序列中不包含snp位点，特别是引物3’端序列尤为重要，如果存在snp点可能会出现扩增丢失；c、引物序列需要利用ncbi进行blast比对，保证序列的特异性；d、确保所有引物具有相近的熔炼温度，确保同一退火温度下，具有相近的扩增效率。

随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。

便于说明的目的，本申请仅仅提供一个实施例来保证试剂盒的扩增特异性及效率。

具体的，根据ncbigenbank中公布的上述基因座的序列信息，采用primer5.0软件设计引物，然后使用oligo7软件对设计的引物进行评价，优选扩增效率高的引物，最后，再通过ncbi数据库中的primerblast在线引物比对工具，进一步筛选高特异性引物。通过上述步骤设计的引物，再经单扩测试，作进一步优选。

将上述筛选的32个基因座引物进行混合测试，排查可能引起非特异扩增的引物，然后重新设计，直至每个基因座引物的扩增子大小为90～480bp之间，且无二聚体峰和非特异扩增现象。最后，根据每个基因座的引物扩增效率，调整复合扩增体系中的引物浓度至表3所示。

表3：32个y染色体基因座引物信息

其中，表3中的每个基因座的扩增引物序列中，至少一条采用荧光染料标记其5′端。关于荧光染料标记引物的详细描述可以在本申请的其他地方找到，如实施例2中所述。

在确定32个基因座的复合扩增引物体系的基础上，通过大量重复实验进一步确定扩增中的其他参数，如：酶量、缓冲液离子强度、模板dna量、复合引物量、循环参数、退火温度以及延伸温度和时间等。以期达到试剂盒的分型精准度高、均衡性好、特异性强和灵敏度优等目标要求(如表4和表5)。

在一些实施例中，本申请的试剂盒可以包括反应混合液、热启动酶、32个基因座的复合引物、32个基因座的等位基因分型标准物、dna标准品、荧光分子内标、和/或sdh2o。

在一些实施例中，人基因组dna的提取方法可以包括利用chelex法、磁珠提取法或有机抽提法。在一些实施例中，人基因组dna可以采用免提取的滤纸、fta卡、棉签、唾液卡、或纱布中一种或其任意组合的载体收集的含有人基因组dna人类血液或口腔细胞。在一些实施例中，人基因组dna的来源可以包括含有人基因组dna的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官等中的一种或其任意组合。例如，人基因组dna可以是1.0或1.2mm孔径的血斑；又例如，人基因组dna可以是1.0或1.2mm孔径的唾液斑；再例如，人基因组dna可以是采用磁珠法或者chelex-100法或者有机纯化法提取的0.1ng-2ng人基因组。

表4：pcr扩增体系及其组分

表5：pcr循环参数

实施例4试剂盒的应用

基于基因座引物设计和复合扩增体系建立，本申请的试剂盒可以应用于法医鉴定、亲权鉴定或dna家谱构建。

本申请试剂盒具体使用步骤可以包括如下：

1、提取人基因组dna，具体的操作方式可以参考实施例3中表4及其所述；

2、目标等位基因扩增：参照表4所示的组分，配制扩增体系，置于pcr仪上，然后参照表5的扩增程序，扩增目标等位基因，得到扩增产物；

3、扩增产物的电泳检测：取荧光分子量内标agcumarkersiz-500与去离子甲酰胺，按体积比1/25的比例混合组成上样混合物；将12.5μl的上样混合物分别与1.0μl的扩增产物、32个基因座的等位基因分型标准物混合，于离心机中4000rmp离心3min，去除气泡；将其置于pcr仪上，95℃变性3min，然后转至低温冰箱中，静置3min，最后使用遗传分析仪进行电泳检测；

4、分型分析：采用片段分析软件genemapperid-x分析上述遗传分析仪检测收集的数据。

实施例5：等位基因分型标准物组配

等位基因分型标准物为分型的标准，用于对个人进行分型鉴定。根据最终确定的每个基因座的引物特点，将上述收集的每个基因座的不同分型集合到一起。本发明所述的试剂盒的等位基因分型标准物的分型图，包含目前已发现的所有标准等位基因，如图2所示。

实施例6：种属特异性

试剂盒检验马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼和大肠杆菌dna，在分型范围内，不出现特异的dna分型，说明本发明具有较好的种属特异性。

实施例7：检材适用性

本发明检材适用性广，对人源的棉签采集提取样本、fta血卡、唾液卡样本均能正确分型。如图4至图6所示。具体如下：

图3所示为标准dna9948的分型图，该图表明本发明可对阳性dna标准品9948进行正确分型；

图4所示为试剂盒对棉签提取样本的分型图；其表明本发明可对棉签采集类样本，在提取的基础上进行正确分型；

图5所示为试剂盒对fta血卡样本的分型图；其表明本发明可对血卡采集类样本，在不经提取的情况下进行直接检测，且能正确分型；

图6是所示的试剂盒对唾液卡样本的分型图；其表明本发明可对唾液卡采集类样本，在不经提取的情况下进行直接检测，且能正确分型。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>无锡市公安局刑事科学技术研究所

无锡中德美联生物技术有限公司

<120>一种同时检测32个y染色体基因座的复合扩增试剂盒

<141>2019-04-04

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acaaataaggtgggatggat20

<210>43

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>43

gagcccatgccattcaaac19

<210>44

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>44

gctcattttctctcttctccactttaa27

<210>45

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>45

ctattccaattacatagtcctcc23

<210>46

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>46

gttgaaatgatggcactgca20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cttcaatgtccatagtgccg20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>48

atcgatgttgagcaggatcc20

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>51

tctttaccttctgggaaactgatcc25

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgttctttctgcttagtactgtg23

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<211>26

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accagaactagatttattcacggttg26