快速检测小麦光周期基因Ppd-B1甲基化水平的引物、方法及应用与流程

本发明属于分子生物技术与育种应用领域，具体地说，涉及一种快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平的引物、方法及应用。

背景技术：

小麦(triticumaestivuml.)是重要的粮食作物，培育高产优质小麦品种对解决全球粮食问题具有重要意义。在小麦“绿色革命”中，光周期不敏感特性决定的地域间广泛适应能力是高产小麦的重要特征。深入研究控制小麦光周期不敏感位点形成的机理，开发简便有效的分子标记并将其应用于生产实践，对于提高小麦对环境的适应性，扩大引种范围都具有重要意义。

小麦有三个控制光周期的主效基因，根据光周期不敏感型定名为ppd-1、ppd-2、ppd-3，分别把它们定位于小麦2d、2b和2a染色体上，也称ppd-d1、ppd-b1、ppd-a1(welshjr,keimdl,pirastehb,etal.geneticcontrolofphotoperiodresponseinwheat.proceedingofthe4thinternationalwheatgeneticssymposium.universityofmissouri,columbia,mo,usa.1973:897-884.；lawcn,sutkaj,worlandaj.geneticstudyofday-lengthresponseinwheat.heredity,1978,41:185-191.)。ppd-b1基因是小麦重要光周期基因，该基因对小麦光周期不敏感性具有重要作用。sun等(sunh,guoz,gaol,zhaog,zhangw,zhour,wuy,wangh,anh,jiaj.dnamethylationpatternofphotoperiod-b1isassociatedwithphotoperiodinsensitivityinwheat(triticumaestivum).newphytologist,2014,204(3),682-692.)研究表明ppd-b1基因启动子区域的dna甲基化水平影响其光周期不敏感位点的形成，甲基化水平与小麦重要农艺性状包括抽穗期、株高、千粒重存在相关性，高甲基化类型在小麦品种选育过程中受到选择。开发能够快速鉴定ppd-b1甲基化水平的分子标记，对于辅助小麦分子育种及抽穗期遗传改良均具有重要意义。

目前，已报道两种检测ppd-b1基因dna甲基化水平的方法：重亚硫酸盐测序法(bisulfitegenomicsequencing)和联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combinedbisulfiterestrictionanalysis)(sunetal.,2014)。上述两种方法尽管可以鉴定ppd-b1基因dna甲基化水平，但是鉴定成本高且所需时间长，具体比较如下：

(1)重亚硫酸盐测序法：鉴定一份样品费用如下：①重亚硫酸盐转化基因组dna(zymoresearch：30元/1次反应)；②pcr扩增(takaraepitaq^tmhs：8元/50ul反应体系)；③胶回收(天根：4元/1次反应)；④连接(全式金peasy-t1cloningkit：25元/1次反应)；⑤克隆测序(上海生工：180元/至少10个克隆测序)。综上，鉴定一份样品需要至少约250元。且该方法不仅费用昂贵，而且需2～3天的时间才能获得结果。

(2)联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(combinedbisulfiterestrictionanalysis)。该方法简化了重亚硫酸盐测序法的实验成本和反应时间。但由于该方法同样包含重亚硫酸盐转化基因组dna的步骤，反应成本仍相对较高。鉴定一份样品费用如下：①重亚硫酸盐转化基因组dna(zymoresearch：30元/1次反应)；②pcr扩增(天根2×taqpcrmastermix：2.5元/50ul反应体系)；③酶切鉴定(neb：2.5元/50ul反应体系)。综上，鉴定一份样品需要至少约35元，大概5～6小时可获得鉴定结果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平的引物、方法及应用，本发明是快速鉴定ppd-b1基因dna甲基化水平的方法，运用甲基化敏感限制性内切酶法(methylationsensitiverestrictionendonuclease，msre)原理，根据ppd-b1基因启动子区域的甲基化差异，设计针对甲基化区域的分子标记。msre是一类对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶：若鉴定材料的ppd-b1甲基化水平高，则msre不能切开含有识别位点的区域；若ppd-b1甲基化水平低，则msre能够正常识别并切开该区域。酶切产物可以则可利用新设计引物运用pcr技术扩增鉴定。该鉴定方法不仅结果准确，而且大大降低了反应成本和反应时间。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平的引物，包括ppd-b1-hpaii-f1和ppd-b1-hpaii-r1，其核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明还公开了一种快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平的方法，包括以下步骤：

步骤1、利用ctab法提取小麦材料基因组dna；

步骤2、对小麦材料基因组dna进行酶切处理；

步骤3、对酶切后的产物进行pcr扩增处理；

步骤4、用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如获得扩增产物的分子量为586bp的扩增片段，表明鉴定材料为ppd-b1高甲基化类型，否则表明鉴定材料为ppd-b1低甲基化类型。

可选地，所述步骤2中的酶切体系如下：10×nebuffer2.5μl，bstui或hpaii0.5μl，600ng/μldna3.0μl，ddh2o19.0μl，总量为25.0μl。

可选地，所述步骤2中的酶切条件如下：bstui酶切样品置于60℃，酶切15min；hpaii酶切样品置于37℃，酶切15min。

可选地，所述步骤3中的pcr体系如下：酶切产物1μl，10μmppd-b1-hpaii-f11μl，10μmppd-b1-hpaii-r11μl，2×pcrmastermix12.5μl，ddh2o9.5μl，总量为25.0μl。

可选地，所述步骤3中的pcr反应程序如下：①预变性94℃，5min；②94℃变性，30s；62℃退火，40s；72℃延伸，40s；40个循环；③72℃，延伸10min；④4℃，保存。

本发明还公开了一种上述的引物、方法在快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平中的应用。

本发明还公开了一种上述的引物、方法在在小麦育种中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明利用甲基化敏感限制性内切酶法(methylationsensitiverestrictionendonuclease,msre)原理，根据ppd-b1基因启动子区域的甲基化差异，设计针对甲基化区域的分子标记，此法在鉴定ppd-b1基因甲基化水平未见报道。

2)本发明同时增设两种甲基化敏感性内切酶hpaii或bstui，同步进行酶切鉴定，两种酶切结果互相印证。只有两种酶切结果一致时，证明结果可信。

3)本发明运用甲基化敏感限制性内切酶法(methylationsensitiverestrictionendonuclease,msre)原理，根据ppd-b1基因启动子区域的甲基化差异，设计针对甲基化区域的分子标记。鉴定一份样品费用如下：①酶切鉴定(neb：2.5元/50ul反应体系)；②pcr扩增(天根2×taqpcrmastermix：2.5元/50ul反应体系)。综上，鉴定一份样品需要约5元，大概2～3小时即可获得鉴定结果。

4)本发明鉴定方法较已有检测方法，在保证鉴定结果准确的基础上，大大降低了反应费用，节约了反应成本和反应时间。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明新开发标记检测5份小麦材料甲基化水平；其中，1：am3；2：莱州953；3：中国春；4：鲁麦14；5：偃展1号；

图2是本发明重亚硫酸盐测序法检测5份小麦材料甲基化水平；1：am3；2：莱州953；3：中国春；4：鲁麦14；5：偃展1号。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平的方法的建立：

(1)ppd-b1甲基化分子标记的引物位置和序列：

根据ppd-b1甲基化差异区域，选择含有甲基化敏感性限制性内切酶hpaii或bstui识别位点(ccgg或cgcg)的区域(-1250～-665)，设计分子标记引物，目的片段长度为586bp(其核苷酸序列如seqidno.3所示)。检测目标材料甲基化类型时，先用hpaii或bstui酶切待测材料dna，酶切产物用新开发的标记扩增。根据目标片段的有无可以快速检测ppd-b1的甲基化类型。

引物名称和序列如下：

ppd-b1-hpaii-f1：ggggccttaagatcgccgatg

ppd-b1-hpaii-r1：cgtggacgaaatggaggc

设计引物序列如下(为引物位置，斜体加粗为hpaii的识别位点，下划线为bstui的识别位点)：

(2)小麦基因组dna的提取：

利用ctab法提取小麦材料基因组dna。

(3)酶切反应体系和酶切条件：

酶切体系(25μl)如下：

同时增设对照组，即用ddh2o替代bstui或hpaⅱ酶，体系不变。

酶切反应条件：

bstui酶切样品和对照组样品置于60℃，酶切15min；

hpaⅱ酶切样品和对照组样品置于37℃，酶切15min。

(4)pcr反应体系和条件：

pcr体系(25μl)如下：

pcr反应程序：

①预变性94℃，5min；②94℃变性，30s；62℃退火，40s；72℃延伸，40s；40个循环；③72℃，延伸10min；④4℃，保存。

(5)琼脂糖电泳检测pcr产物：

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据目标片段的有无可以快速检测ppd-b1的甲基化类型，有扩增条带表明鉴定材料为ppd-b1高甲基化类型，无扩增条带表明鉴定材料为ppd-b1低甲基化类型。

实施例2鉴定结果例：

分别用本发明开发的分子标记和重亚硫酸测序法检测已报道甲基化水平的5份代表材料：am3(1号，低甲基化)、莱州953(2号，低甲基化)、中国春(3号，高甲基化)、鲁麦14(4号，高甲基化)和偃展1号(5号，高甲基化)。本发明技术鉴定结果如图1所示，从图中可得出，1号和2号材料经bstui和hpaⅱ酶切和pcr扩增后，与对照组比较无条带，而3号、4号和5号材料与对照组比较有条带。利用重亚硫酸测序法利用已报道检测方法(sunh,guoz,gaol,zhaog,zhangw,zhour,wuy,wangh,anh,jiaj.dnamethylationpatternofphotoperiod-b1isassociatedwithphotoperiodinsensitivityinwheat(triticumaestivum).newphytologist,2014,204(3),682-692.)，对上述材料进行测序，分析甲基化水平(图2)。由图2可得出，1号和2号甲基化水平较3号、4号和5号材料甲基化水平低。所以，本发明新开发标记可以准确鉴定小麦材料的ppd-b1基因dna甲基化水平。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>鲁东大学

<120>快速检测小麦光周期基因ppd-b1甲基化水平的引物、方法及应用

<130>2019

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggggccttaagatcgccgatg21

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgtggacgaaatggaggc18

<210>3

<211>586

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>3

ggggccttaagatcgccgatgctaaacgcagccttacgcacatcatcagccgtgtacttc60

tttctctatgaagttggcttcagacaaatcctgtatgcagagcaaaaaagaaaaccgagg120

gaggatttgaaagggggcggaaccttggagcggtatttggtcacacgagcaaaatccatg180

gcaagcgcttcttcacactagggctggtcgaagaggatggattgagttgacggctccagc240

gttccagggctcccctcgactccttcgactccaccaccgttgccaaggagttgattgaga300

ggcgagcgagggcagccgtccgtccacgcgtcggcacccggtttgtcccggcgccaagca360

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