紫色红曲菌中调控因子LaeA过表达菌株的构建方法与流程

本发明涉及一种紫色红曲菌中调控因子laea过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、monacolink、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，monacolink又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，monacolink具有抑制胆固醇合成中关键酶hmg-coa活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，monacolink被国内外视为降胆固醇的理想药

laea基因是近些年来被发现的一种丝状真菌中的全局调控因子，它对多种次级代谢基因簇的表达都具有调控作用，例如：次级代谢产物的生成，菌体的生长及形态变化等。虽然laea基因完整的作用机制还尚未清楚，但是部分结构已被发现。bob等人发现构巢曲霉中的laea基因含有一个内含子和3个假定的aflr结合位点，且还具有一个保守功能结构域，其功能主要与核蛋白甲基转移酶硫腺苷甲硫氨酸结合位点相似。随后的研究发现，laea基因在多种丝状真菌中都普遍存在，例如：黄曲霉、橘青霉、炭黑曲霉等。

目前，laea基因在红色红曲菌和丛毛红曲菌中均已发现，但在紫色红曲菌中还尚未有报道。所以本研究先对紫色红曲菌m1的转录组进行laea基因的克隆，以探究紫色红曲菌m1中是否存在laea基因。将laea基因与过表达质粒pbc-hygro连接，采用电击转化法将重组质粒导入紫色红曲菌m1中，利用潮霉素抗性平板筛选阳性转化子，通过hplc检测和潮霉素基因组的扩增，筛选出laea基因过表达的目的工程菌株。对筛选出的工程菌株次级代谢产物、菌丝体形态及基因表达量进行检测，从而探究laea基因在紫色红曲菌m1中对代谢、生长及基因表达的作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫色红曲菌中调控因子laea过表达菌株的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

紫色红曲菌中调控因子laea过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

1)设计了一对引物laea-f和laea-r，

2)通过pcr扩增紫色红曲菌基因组中的laea基因；

3)将扩增得到的laea基因连接到pbc-hygro原核表达载体上，筛选出两个单酶切位点quickcutxbai和quickcutxhoi，扩增的laea靶基因经双酶切连接，构建pbc高表达质粒；

然后对重组质粒进行验证。（1）重组质粒琼脂糖凝胶电泳检测：用1%琼脂糖凝胶电泳检测5μl的重组质粒。(2)双酶切：利用quickcutxbai和quickcutxhoi对重组质粒进行酶切，如果酶切产物有两个条带，条带大小与质粒大小和目标片段大小一致，则成功构建重组质粒。

4)制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到laea过表达菌株。

本发明的有益效果：

本发明成功的克隆出了紫色红曲菌中的全局调控基因laea，通过与ncbi比对发现紫色红曲菌中的laea基因与丛毛红曲菌的同源性为99%，与红色红曲菌同源性为92%。将得到的laea基因在紫色红曲菌中进行过表达，从而探究laea基因在紫色红曲菌中的功能。

通过hplc检测和潮霉素基因组的扩增，筛选出laea基因过表达的目的工程菌株。对筛选出的工程菌株次级代谢产物、菌丝体形态及基因表达量进行检测，从而探究laea基因在紫色红曲菌m1中对代谢、生长及基因表达的作用。

通过紫外分光光度计分别检测工程菌株和m1菌株的红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素。工程菌株的三种色素产量均高于普通m1菌株。在第12d时，工程菌株三种色素的产量与m1菌株相比分别提高了73.5%，74.5%和77.1%。

附图说明：

图1是laea基因pcr产物电泳图。泳道1：dl2000dnamarker；泳道2,3：laea基因pcr扩增产物。

图2是laea基因序列比对图，左图：与丛毛红曲菌序列对比结果图；右图：与红色红曲菌序列对比结果图。

图3是laea基因树。

图4是pbc-hygro-laea重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图。

图5是红曲菌m1菌株对潮霉素b的耐受浓度

图6是导入质粒菌株的筛选结果，第一行：m1菌株；第二行：加入质粒的m1菌株

图7是导入pbc-hygro-laea质粒的红曲菌转化子monacolink产量分析

图8是l3菌株潮霉素转录组的pcr电泳图，泳道1：dl2000dnamarker；泳道2：m1菌株；泳道3,4,5：l3菌株。

图9是l3和m1菌株monacolink产量检测

图10是l3菌株色素产量检测，a：红曲红色素；b：红曲橙色素；c：红曲黄色素

图11是l3菌株生物量检测

图12是l3与m1菌株在不同倍率下扫描电镜图。a：m1菌株5000×；b：l3菌株5000×；c：m1菌株10000×；d：l3菌株10000×。1：凹陷；2：颗粒；3：褶皱。

具体实施方式：

实施例1

本实施例提供一种紫色红曲菌中调控因子laea过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

1)设计了一对引物laea-f和laea-r，具体如下：

上游引物：tgcgttggcctgatgtttggac

下游引物：tcaattggaaattggcttccgtgct

2)通过pcr扩增紫色红曲菌基因组中的laea基因；

3)将扩增得到的laea基因连接到pbc-hygro原核表达载体上，筛选出两个单酶切位点quickcutxbai和quickcutxhoi，扩增的laea靶基因经双酶切连接，构建pbc-hygro-laea高表达质粒；

然后对重组质粒进行验证。（1）重组质粒琼脂糖凝胶电泳检测：用1%琼脂糖凝胶电泳检测5μl的重组质粒。(2)双酶切：利用quickcutxbai和quickcutxhoi对重组质粒进行酶切，如果酶切产物有两个条带，条带大小与质粒大小和目标片段大小一致，则成功构建重组质粒。

4)制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到laea过表达菌株。

实施例2重组质粒验证

一、laea基因的扩增

以红曲菌m1的cdna为模板，以laea-f、laea-r为上下游引物通过pcr扩增laea基因片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。pcr扩增后得到一条大小为1200bp左右的单一条带，与预期大小一致。将产物进行测序再与ncbi上公布的laea基因的序列进行对比，结果如图2所示，得到该目的片段序列与丛毛红曲菌中laea基因（ncbiaccession：dq178028.1）的同源性为99%，与红色红曲菌中laea基因（ncbiaccession：km401564.1）的同源性为92%。再通过mega6软件构建基因树，根据基因树进一步鉴定，结果如图3所示，该目的片段为laea基因。

二、重组质粒的验证

构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用quickcutxhoⅰ和quickcutxbaⅰ进行双酶切验证。结果如图4所示，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和1200bp左右的两段目的片段。与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功

实施例3本发明制备的laea过表达菌株的验证

3.1红曲菌m1菌株潮霉素b浓度筛选

取100μl红曲菌m1菌株孢子悬液涂布于0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml和15μg/ml的不同浓度梯度的潮霉素b抗性平板上，从而筛选最佳抑制浓度。结果如图5所示，由图可知，随着潮霉素b浓度的增长，红曲菌m1菌株的菌落数逐渐减少，当潮霉素b浓度为10μg/ml时，红曲菌生长的较少，只有单一菌株出现；当潮霉素b浓度为15μg/ml时，红曲菌m1菌株无菌落生长。因此，选取潮霉素b浓度为15μg/ml为筛选抑制浓度。

根据实施例1的方法制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，再结合上述潮霉素b浓度筛选浓度结果，筛选导入过表达质粒的转化子。结果如图6所示，从图中看出，随着潮霉素b浓度的增加，加入质粒和未加入质粒的红曲菌m1菌株的菌落数都逐渐减少；当潮霉素b浓度为10μg/ml时，加入质粒的红曲菌m1菌株的菌落数明显多于未加入质粒红曲菌m1菌株；当潮霉素b浓度为15μg/ml时，加入质粒的红曲菌m1菌株有菌落生长，而未加入质粒的红曲菌m1菌株则无菌落生长。因此，挑取潮霉素b浓度为15μg/ml抗性板上的菌落，从而成功获得具有潮霉素b抗性的转化子。将获得的转化子在具有潮霉素b抗性的平板上传5代，再进行发酵培养，对其monacolink的产量以及潮霉素b基因组进行测定，以筛选出目的转化子。

3.2高产monacolink的红曲菌转化子菌株筛选

将潮霉素b抗性平板上挑取的转化子进行传代培养后，得到13个遗传稳定的转化子，分别命名为l1-l13。对13株转化子进行发酵培养12d后，通过hplc进行monacolink产量的检测，筛选目的红曲菌转化子。结果如图7所示，l3菌株monacolink产量最高，为240.26mg/l。与原始菌株m1相比monacolink产量提高了1.5倍。除l3菌株外，l1、l8、l11菌株monacolink产量也明显提高，分别为207.80mg/l，225.32mg/l和216.85mg/l。所以，选取l3菌株为目的菌株，对其进行潮霉素b基因组pcr验证。

3.3过表达菌株l3潮霉素基因的pcr验证

通过hplc初步筛选出高产monacolink的转化子l3后，对l3菌株进行潮霉素基因的pcr验证。分别提取红曲菌m1菌株和l3菌株的rna，再将其反转录成cdna。以cdna为模板，hygro-f和hygro-r为引物进行扩增潮霉素基因。结果如图8所示，对照菌株红曲菌m1菌株未能扩增出明显条带，而l3菌株能扩增出明显条带，说明l3菌株中成功的导入了过表达质粒，laea过表达菌株构建成功。

3.4过表达菌株l3的monacolink产量检测

将l3菌株和m1菌株进行摇瓶发酵培养，通过hplc分别检测两种菌株5，8，12，15d时monacolink产量，结果如图9所示。由图可知，12d时过表达l3菌株与m1菌株相比monacolink产量提高了48.6%；达到了165.16mg/l，15d时提高了25.3%，产量为210.18mg/l。

3.5过表达菌株l3的红曲色素产量检测

通过紫外分光光度计分别检测2，5，8，12，15d的l3菌株和m1菌株的红曲红色素、红曲橙色素和红曲黄色素。结果如图10所示，由图得三种色素的产量变化总体呈现一致性，均是表现为先上升再下降的趋势，在第12d时产量达到最高。通过对比l3和m1菌株发现，l3菌株的三种色素产量均高于普通m1菌株。在第12d时，l3菌株三种色素的产量与m1菌株相比分别提高了73.5%，74.5%和77.1%。

3.6过表达菌株l3生物量的检测

通过比较l3菌株和m1菌株在不同阶段的红曲菌菌丝体干重量的差异，研究laea基因的过表达对红曲菌菌丝体干重的影响。结果如图11所示，由图可知，l3菌株和m1菌株菌丝体变化趋势一致，且差异并不明显。

3.7过表达菌株l3微观菌体形态的检测

通过扫描电镜检测l3菌株和m1菌株菌丝体的形态差异，结果如图12所示，对比图a和图b可知，l3菌株的菌丝体与m1菌株相比更为饱满；对比图c和图d可知，l3菌株的菌丝体凹陷程度、颗粒数及褶皱程度明显多于m1菌株。因此推测，laea基因的过表达可能会刺激胞内物质分泌到胞外，从而使红曲菌菌丝体的形态发生改变，进而影响次级代谢产物在发酵液中的产量。

序列表

<110>北京工商大学

<120>紫色红曲菌中调控因子laea过表达菌株的构建方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgcgttggcctgatgtttggac22

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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