本发明涉及一种snp标记及其用途，具体地，涉及一种与斜带石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记及其用途。
背景技术：
：石斑鱼是名贵的海水经济鱼类。近十多年来，石斑鱼人工繁育技术已相对成熟，石斑鱼的养殖规模也逐渐扩大，石斑鱼产业的迅速发展，对于促进渔民增收，满足国民水产品需求，优化水产养殖业结构有重要意义。但是，种质退化，优良品种缺乏是石斑鱼产业可持续健康发展的主要瓶颈。因此，培育石斑鱼优良新品种已成为我国石斑鱼产业发展的关键。另一方面，高密度的养殖模式，比如工厂化循环水养殖，已成为石斑鱼养殖的主要方式。高密度养殖容易使水体的氨氮浓度处于高水平且不易去除，从而影响鱼体的生长和免疫能力。因此，以氨耐受能力为选育目标是石斑鱼优良新品种选育的重要方向。传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用dna分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种中的作用将日益突出。在石斑鱼的育种中，人们希望通过对于目标性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的dna标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得更大的遗传进展。然而，现阶段能够有效用于石斑鱼育种的氨耐受能力相关的分子标记仍有待挖掘。技术实现要素：本发明的目的是提供一种与石斑鱼氨耐受能力相关、能够有效用于石斑鱼选育的snp标记，和用于检测前述snp标记的引物对和试剂盒，前述snp标记、引物对、试剂盒在斜带石斑鱼选育中的用途，以及检测斜带石斑鱼氨耐受能力的方法，可以解决现有技术中存在的问题。为了达到上述目的，本发明提供了一种与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记，其中，该snp标记的核苷酸序列如seqidno.1所示。该序列自5’端起第501位碱基是g或t。上述的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记，其中，所述的snp标记用于进行石斑鱼分子标记辅助育种。本发明还提供了一种用于检测上述的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物，其中，所述的引物是包含上游引物和下游引物的引物对。上述的用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物，其中，所述的上游引物序列为：5’-cgatgtaatccaacatttcctga-3’(seqidno.2)；所述的下游引物序列为：5’-gattacaggggaaaaactgcagagc-3’(seqidno.3)。上述的用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物，其中，所述的引物，在使用时通过其将待测石斑鱼的与氨耐受能力相关的snp标记所在的片段进行pcr扩增，再通过测序实现对所述snp标记的检测，确定待测石斑鱼的所述snp标记位点的基因型，从而确定待测石斑鱼的氨耐受能力。上述的用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物，其中，所述的确定待测石斑鱼的所述snp标记位点的基因型，是指确定所述snp标记位点的碱基，从而确定待测石斑鱼的所述snp标记位点的基因型为tt还是gt。上述的用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物，其中，所述的snp标记位点处的基因型为杂合gt的石斑鱼的氨耐受能力显著高于该处基因型为纯合tt的石斑鱼，从而确定待测石斑鱼的氨耐受能力。本发明还提供了一种用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的试剂盒，其中，所述的试剂盒内包含上述的引物对。本发明还提供了一种上述的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记、用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物以及试剂盒的用途，其中，所述的snp标记、引物以及试剂盒用于石斑鱼选育，在使用时通过检测确定待测石斑鱼的所述snp标记的基因型，基于获得的基因型确定待测石斑鱼的氨耐受能力，从而辅助石斑鱼选育。本发明也提供了一种使用上述的snp标记、引物以及试剂盒检测石斑鱼氨耐受能力的方法，其中，所述的方法是通过所述snp标记、引物以及试剂盒，对待测石斑鱼进行pcr扩增、测序，检测确定待测石斑鱼的所述snp标记的基因型，进而基于获得的基因型确定待测石斑鱼的氨耐受能力。本发明提供的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记及其用途具有以下优点：(1)本发明提供的snp标记不受斜带石斑鱼的年龄、性别等限制，可用于斜带石斑鱼的早期选育，可显著促进斜带石斑鱼的育种进程。(2)检测斜带石斑鱼如seqidno.1所示自5’端起第501位snp位点的方法，准确可靠，操作方便。(3)斜带石斑鱼如seqidno.1所示自5’端起第501位的snp位点的检出，为斜带石斑鱼生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式作进一步地说明。本发明提供的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记，该snp标记的核苷酸序列如seqidno.1所示(全长1001bp)，自5’端起第501位碱基以y表示，y代表g或t。snp标记的核苷酸序列如下：ttatgttatgttacgttgacacttcttgctgatcttggacctgagctgcagtccactaaacacacacagataacacacatgcaccacacaccttgtgtgaagcagaacaagctgtgaactcgactttattataaagattcaattgatcatcttttctttcgtcatttccacaactatgggcagaagacacacacacacacacacacacacacagcttggtttgcctctttcaggcctcacaataggtgtgaggatgaagtgttttcaaacttagtccttgtggagttaataaccactacctgcctaactcctatcttgatttttttggcctgttcaactgcagtggaaacaagaggggctttccaattggcaagatgattcactcgctgtgaacaaaaaaaaaatagaagtggaattgtaagacagtttttgactaagatggatgcacacacaacagtttgtgtctcagtaggataccgatgtaatccaacatttcctgaygctctgcagtttttcccctgtaatctattaaaaactacagtagcattcatatggagttgtgcatctggccaccagacgaatgtgaaggccttggtatgttcagctgaagtttaaactttctgatgtcaaattggagggggagccttatccgacaatttctgtaactgcacacatttcaaaatgacagtgaaagctctcttttcagataaaagcagaaagatacctttactatatttccacataccattgttagccttaaggtgtgtaatctattattttcttgacaaagaggaaaaacatacttgattctggaattatttcacttgttcctcattttgctgaaattgacctttctgatcctgtttctctttgcttttgagaatttcagatgaacaaactgaggctgtagtgttgtaatattgaatacatacagtctcgaaaagggactgcggcaggaaatggcctgcagccagtttggcttgacttcaggtcagtgagta(seqidno.1)。snp(singlenucleotidepolymorphism,snp，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。该snp标记用于进行石斑鱼分子标记辅助育种。该snp位点处基因型为杂合gt的斜带石斑鱼在56.2mg/lnh4cl48小时胁迫下仍能存活，而此处基因型为纯合tt的斜带石斑鱼则未能存活。进而，通过检测斜带石斑鱼的该snp，能够有效地确定其氨耐受能力。具体地，如前所述，该snp位点为杂合gt的斜带石斑鱼的氨耐受能力显著高于此处基因型为纯合tt的斜带石斑鱼，例如该snp位点的基因型为gt时，则能够确定待测斜带石斑鱼的属于氨耐受能力强的个体。因此，发明人确定，本发明的snp标记与斜带石斑鱼的氨耐受能力紧密相关，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对斜带石斑鱼育种材料进行早期选择，进一步提高育种的效率和准确性，提高斜带石斑鱼繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出斜带石斑鱼优良品种。利用本发明的snp标记进行斜带石斑鱼分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。本发明还提供了一种用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物，该引物是包含上游引物和下游引物的引物对。该引物对具有seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列。该引物对的序列如下所示：上游引物序列为：5’-cgatgtaatccaacatttcctga-3’(seqidno.2)；下游引物序列为：5’-gattacaggggaaaaactgcagagc-3’(seqidno.3)。该引物在使用时通过其能够有效地将待测石斑鱼的与氨耐受能力相关的snp标记所在的片段进行pcr扩增，再通过测序能够有效实现对该snp标记的检测，确定待测斜带石斑鱼的该snp标记位点的基因型，从而能够有效确定待测石斑鱼的氨耐受能力。确定待测石斑鱼的该snp标记位点的基因型，是指确定该snp标记位点的碱基，从而确定待测石斑鱼的该snp标记位点的基因型为tt还是gt。该snp标记位点处的基因型为杂合gt的石斑鱼的氨耐受能力显著高于该处基因型为纯合tt的石斑鱼，从而确定待测石斑鱼的氨耐受能力。因此，本发明提供的用于检测该snp标记的引物对，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。本发明还提供了一种用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的试剂盒，该试剂盒内包含用于检测本发明的snp标记的该引物对。该引物对包含seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列。利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测斜带石斑鱼的该与氨耐受能力相关的snp标记的多态性检测，确定待测斜带石斑鱼该snp标记位点的基因型，进而能够有效确定待测斜带石斑鱼的氨耐受能力。具体地，该snp标记位点处基因型为杂合gt的斜带石斑鱼的氨耐受能力显著高于此处基因型为纯合tt的斜带石斑鱼，例如该snp位点的基因型为gt时，则能够确定待测斜带石斑鱼属于氨耐受能力强的个体。因此，本发明的用于检测该snp标记的试剂盒，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。本发明还提供了一种与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记、用于检测与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的引物以及试剂盒的用途，该snp标记、引物以及试剂盒用于斜带石斑鱼选育，在使用时通过检测确定待测石斑鱼的snp标记的基因型，基于获得的基因型确定待测石斑鱼的氨耐受能力，从而辅助石斑鱼选育。通过能够用于检测本发明的与斜带石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的试剂例如该引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测斜带石斑鱼的该snp标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测斜带石斑鱼的氨耐受能力，从而能够有效辅助斜带石斑鱼选育。本发明也提供了一种使用snp标记、引物以及试剂盒检测斜带石斑鱼氨耐受能力的方法，该方法通过对待测斜带石斑鱼进行本发明的snp标记的检测，确定待测斜带石斑鱼的氨耐受能力。具体地，是通过能够用于检测本发明的与斜带石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的试剂例如该引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测石斑鱼进行pcr扩增、测序，检测确定待测石斑鱼的snp标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测石斑鱼的氨耐受能力。该snp标记位点处基因型为杂合gt的斜带石斑鱼的氨耐受能力显著高于该处基因型为纯合tt的斜带石斑鱼，例如当该snp位点的基因型为gt时，则待测斜带石斑鱼的属于氨耐受能力强的个体。因此，本发明的检测斜带石斑鱼氨耐受能力的方法，能够快速、高效、准确地检测斜带石斑鱼氨耐受能力，进而能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。对待测斜带石斑鱼进行snp标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(pcrsinglestrandconformationpolymorphism，pcr-sscp)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(pcr-restritcionfragmentlengthpolymorphism，pcr-rflp)及飞行时间质谱等技术均可以实现snp的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在snp位点的两侧设计一对引物，扩增200-1000bp的产物，再通过测序即可直接检测snp位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行snp标记检测。通过对待测斜带石斑鱼进行本发明的snp标记的检测，确定待测斜带石斑鱼的氨耐受能力，进一步包括：提取待测斜带石斑鱼的基因组dna；利用本发明的引物对，将待测斜带石斑鱼的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；对pcr扩增产物进行测序，获得测序结果；基于测序结果，确定待测斜带石斑鱼的snp标记的基因型；以及基于待测斜带石斑鱼的snp标记的基因型，确定待测斜带石斑鱼的氨耐受能力。因此，能够有效提高检测斜带石斑鱼氨耐受能力的效率。提取待测斜带石斑鱼的基因组dna的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组dna提取方法或试剂盒进行。优选地，采用常规酚氯仿方法抽提待测斜带石斑鱼的基因组dna。因此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组dna，便于后续步骤进行。将待测斜带石斑鱼的基因组dna进行pcr扩增的条件不受特别限制。优选地，该pcr扩增的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl的模板dna1μl，10pmol/μl的如seqidno.2和seqidno.3所示的上下游引物各1μl，10mmol/l的dntpmix2.0μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.125μl，10×pcr反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；该pcr扩增的反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。因此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的snp标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。对pcr扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得pcr扩增产物即snp标记所在的片段的序列即可。优选地，可以采用选自第一代测序、第二代测序和第三代测序方法的至少一种对pcr扩增产物进行测序。因此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。基于测序结果，通过比对石斑鱼参考基因组序列，能够有效确定待测斜带石斑鱼的snp标记的基因型为tt还是gt。该snp标记的gt基因型个体的氨耐受能力显著高于tt基因型个体。即本发明的snp标记与斜带石斑鱼的氨耐受能力紧密相关。因此，基于确定的待测斜带石斑鱼的该snp标记的基因型，能够准确有效地确定待测斜带石斑鱼的氨耐受能力即氨耐受能力性状，例如该snp位点的基因型为gt时，则待测斜带石斑鱼的属于氨耐受能力强的个体。进而本发明的方法能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。下面结合实施例对本发明提供的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记及其用途做更进一步描述。需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：与斜带石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的获得。1.1斜带石斑鱼群体的获得。所采用的群体为海南某石斑鱼养殖场生产的斜带石斑鱼受精卵，亲本为15条雄鱼和26条雌鱼(均为野生斜带石斑鱼的f1代)，2kg受精卵被转运至深圳华大海洋科技有限公司坝光基地孵化。8个月后，随机选出1000个斜带石斑鱼受精卵个体，用于氨耐受实验。1.2斜带石斑鱼氨耐受实验。实验用鱼平均体长18cm，平均体重78g。实验用水为沙滤海水，水温(21±0.5)℃，盐度26-28，ph7.8-8.0，溶解氧4.5-5.5mg/l。根据预实验，该规格的斜带石斑鱼对氨氮(nh4cl)的48小时半致死浓度为56.2mg/l，因此采用该浓度值开展氨耐受实验。实验在面积为4.2m×3.77m的水泥池里进行，每个水泥池的实验水体为9m3，微充气。用2个水泥池(相当于2个平行组)，每个池子放500尾，实验期间不喂食，实验持续48h，然后将存活的鱼移入新鲜的海水中。实验期间48h内死亡的个体作为氨不耐受组，实验结束后存活的个体作为氨耐受组。剪取鱼体背鳍鳍条于95％乙醇-20℃保存，用于基因组dna提取。1.3斜带石斑鱼基因组dna提取。本试验采用常规酚氯仿方法抽提斜带石斑鱼鳍条中的基因组dna，具体步骤如下：(1)取0.3～0.5g鳍条于1.5mleppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥20min。(2)待乙醇基本挥发后，te缓冲液(10mmol/mltris、1mmol/mledta、sds5％，ph＝8.0)洗涤1～2次，再加入600μldna抽提液(0.001mol/ltris-cl、0.1mol/ledta、sds5％，ph＝8.0)和3μl蛋白酶k(200mg/ml)，55℃水浴消化3h左右，前30min每10min轻摇离心管1次，消化至管内液体澄清。(3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)600μl，轻轻来回颠倒离心管10min，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相之间没有白色沉淀。(4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀dna，颠倒混匀，4℃静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70％乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μl无菌水溶解。4℃保存备用或-20℃长期保存。1.4构建基因组测序文库并测序获得斜带石斑鱼体重相关的snp标记。基于hiseqxten高通量测序平台(illumina公司制)，采用基因组重测序方法对300个个体(氨不耐受和氨耐受分别有150个个体)的dna样本进行测序，每个个体产生10g左右的数据量，平均覆盖10x的斜带石斑鱼基因组。采用plink软件对数据进行处理筛选处理，然后使用基于混合线性模型的emmax软件进行gwas分析(genome-wideassociationstudy，全基因组关联分析)，从2,791,699个snp中找到了一个与氨耐受能力显著相关的snp位点。该snp位点位于seqidno.1所示序列的501bp位点处，在seqidno.1序列中用y表示该处位点，且此处位点的碱基为g或t。该位点处基因型为杂合gt的斜带石斑鱼的氨耐受能力显著高于此处基因型为纯合tt的斜带石斑鱼。实施例2：与斜带石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的测序验证与应用。2.1提取待测斜带石斑鱼鳍条中的基因组dna。待测斜带石斑鱼来自实施例1中的斜带石斑鱼群体，选取300尾鱼，按照实施例1中所述的dna提取方法抽提基因组dna。2.2扩增含snp位点的核苷酸片段。以前述提取获得的各待测斜带石斑鱼的基因组dna为模板，利用正向引物f：5’-cgatgtaatccaacatttcctga-3’(seqidno.2)和反向引物r：5’-gattacaggggaaaaactgcagagc-3’(seqidno.3)，扩增出待测snp所在的核苷酸片段。其中，pcr反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板dna1μl，10pmol/μl引物f和r各1μl，10mmol/ldntpmix2.0μl，5u/μltaqdna聚合酶0.125μl，10×pcr反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；pcr反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。2.3测序识别snp位点基因型。将上述步骤中获得的各pcr扩增产物于abi3730测序仪(appliedbiosystems公司制)上，进行单向测序，识别seqidno.1序列中501bp处(即本发明的snp标记)的基因型。其中，300个待测斜带石斑鱼个体该snp位点的基因型及氨耐受能力如下表1所示。表1、300个待测斜带石斑鱼个体该snp位点的基因型及其氨耐受能力。基因型氨耐受能力个数gt耐受135tt不耐受128gg耐受15gg不耐受22基于表1的结果，gt基因型个体的氨耐受能力与tt基因型个体的差异达极显著性水平(p<0.01)。进而，证明seqidno.1所示核苷酸序列自5’端起第501位碱基g或t，与斜带石斑鱼氨耐受能力显著相关，为斜带石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记，该snp标记的gt基因型个体的氨耐受能力显著高于tt基因型个体。本发明提供的与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记，能够快速、高效、准确地检测斜带石斑鱼氨耐受能力，进而能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。〈110〉深圳华大海洋科技有限公司，深圳市华大海洋研究院〈120〉一种与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记及其用途〈160〉3〈210〉1〈211〉1001〈212〉dna〈213〉斜带石斑鱼（epinepheluscoioides）〈220〉〈221〉snp标记〈222〉（501）〈223〉与石斑鱼氨耐受能力相关的snp标记的核苷酸序列〈400〉1ttatgttatgttacgttgacacttcttgctgatcttggacctgagctgcagtccactaaa60cacacacagataacacacatgcaccacacaccttgtgtgaagcagaacaagctgtgaact120cgactttattataaagattcaattgatcatcttttctttcgtcatttccacaactatggg180cagaagacacacacacacacacacacacacacagcttggtttgcctctttcaggcctcac240aataggtgtgaggatgaagtgttttcaaacttagtccttgtggagttaataaccactacc300tgcctaactcctatcttgatttttttggcctgttcaactgcagtggaaacaagaggggct360ttccaattggcaagatgattcactcgctgtgaacaaaaaaaaaatagaagtggaattgta420agacagtttttgactaagatggatgcacacacaacagtttgtgtctcagtaggataccga480tgtaatccaacatttcctgaygctctgcagtttttcccctgtaatctattaaaaactaca540gtagcattcatatggagttgtgcatctggccaccagacgaatgtgaaggccttggtatgt600tcagctgaagtttaaactttctgatgtcaaattggagggggagccttatccgacaatttc660tgtaactgcacacatttcaaaatgacagtgaaagctctcttttcagataaaagcagaaag720atacctttactatatttccacataccattgttagccttaaggtgtgtaatctattatttt780cttgacaaagaggaaaaacatacttgattctggaattatttcacttgttcctcattttgc840tgaaattgacctttctgatcctgtttctctttgcttttgagaatttcagatgaacaaact900gaggctgtagtgttgtaatattgaatacatacagtctcgaaaagggactgcggcaggaaa960tggcctgcagccagtttggcttgacttcaggtcagtgagta1001〈210〉2〈211〉23〈212〉dna〈213〉人工序列〈220〉〈223〉正向引物序列〈400〉2cgatgtaatccaacatttcctga23〈210〉3〈211〉25〈212〉dna〈213〉人工序列〈220〉〈223〉反向引物序列〈400〉3gattacaggggaaaaactgcagagc25当前第1页12