一种辣木籽硒活性成分有效保持的提取方法与流程

本发明涉及辣木籽中活性物质的提取，具体涉及一种辣木籽硒活性成分有效保持的提取方法。

背景技术：

辣木(moringaoleiferalam.)，原产于印度、肯尼亚和埃塞俄比亚等地区，目前在亚洲和非洲等热带和亚热带地区已广泛种植，在我国的云南、海南、广东和广西均有种植。辣木的根、茎、叶、花、种子富含人体所需的硒、钙、镁、钾等多种矿物质，同时也富含氨基酸、维生素a、维生素c和维生素b族元素，是优质的保健品原料。2012年11月，我国卫生部批准辣木叶作为新资源食品。辣木含有黄酮类、皂苷类、多糖类、生物碱、多肽、氨基酸类及不饱和脂肪酸类等具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤、降血糖等作用的生理活性成分。辣木能在极其贫瘠和干旱的环境下迅速生长，其果实还具有净化水的功能，因此被誉为“神奇之树”，“植物中的钻石”。可见辣木具有极高的食用和药用价值。

硒是人体必需的微量元素，人体缺硒可能会导致免疫力下降，甚至克山病、心脏病、高血压、癌症等疾病的发生。有研究采用动物实验证实了硒具有抗多种致癌物质的作用。

已有的研究表明，辣木含无机硒和有机硒，其中有机硒更有利于人体吸收利用。机体内有机硒主要有硒多糖、硒蛋白、硒核酸等。已有研究表明硒多糖的生理活性普遍比多糖和硒高(黄峙等.含硒生物大分子化合物研究进展[j].海南大学学报(自然科学版),2001,19(2):169-175.)，是一种很好的补硒剂。在植物体内存在硒多糖已得到证实(乔伟,陈文强,彭浩,等.富硒香菇发酵液中硒多糖提取工艺的响应面优化[j].北方园艺,2017(12):157-162.)。通常认为天然硒多糖中硒含量特别低，再加上提取过程中的损耗，硒含量很少(刘剑.金花葵富硒及硒多糖的研究[d].陕西科技大学,2018.)

目前已公开的从辣木籽中提取多糖的方法很多，最为传统的方法是采用沸水浸提法，但这种方法提取时间长，沸水的需要量多。公开号为cn108676102a的发明专利公开了一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，具体是将辣木籽细粉与深度共熔溶剂(由氯化胆碱和丙三醇以1：2的摩尔比组成)混合后置于50-70℃恒温水浴锅、240r/min转速下磁子搅拌20-40min，混合物离心，取上清液脱蛋白后得到辣木籽多糖上清液；将辣木籽多糖上清液醇沉后得到辣木籽粗多糖；所得精粗多糖再经deae-52柱层析纯化即得到辣木籽多糖。该发明公开号为cn105418787a的发明专利公开的辣木籽中多糖提取方法为：将粉末状辣木籽放入水中，在温度为78-79℃下提取1h-1.10h，得辣木籽多糖提取液；所述粉末状辣木籽的质量与水的体积比为1g：(55ml-56ml)。该发明通过调控辣木籽的质量与水的体积比及提取问题和时间，使辣木籽多糖提取液中多糖的产率达到14％以上，且减少了水资源的消耗。

然而上述现有技术均未涉及所得辣木籽多糖中硒含量的测定，并不清楚所得辣木籽多糖中是否有效地保持了辣木籽中的硒。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种辣木籽硒活性成分有效保持的提取方法。该方法工艺简单、提取时间短，使辣木籽中的硒及多糖能充分提取出来，并使辣木籽中的硒活性成分有效地保持于提取液中。

本发明所述的辣木籽硒活性成分有效保持的提取方法为：以80v/v％乙醇作为解吸剂，对脱酯的辣木籽粉进行解吸，然后加入80℃热水提取，收集提取液；对提取液脱蛋白，离心，取上清液进行醇沉，收集沉淀，即得到辣木籽硒多糖；其中：

在解吸时，解吸剂的体积ml与脱酯的辣木籽粉的质量g的比值为≥5，解吸的时间为≥25min；

每次提取的时间为≥6min。

上述技术方案中，通过现有常规的方法获得脱酯的辣木籽粉，具体可按下述方法获得：取辣木籽，干燥后粉碎，所得辣木籽粉用石油醚浸泡脱脂，减压蒸馏回收石油醚，残余物即为脱酯的辣木籽粉。其中辣木籽粉和石油醚的用量比优选为1g：3-5ml，浸泡脱脂的时间优选为5-7天。

上述技术方案中，在解吸时，解吸剂的体积ml与脱酯的辣木籽粉的质量g的比值优选为5，解吸的时间优选为25min；每次提取的时间优选为6min，提取的次数优选为2次。

上述技术方案中，80℃热水的用量可根据需要进行确定，优选80℃热水的用量ml与脱酯的辣木籽粉的质量g的比值为≥15，更优选80℃热水的用量ml与脱酯的辣木籽粉的质量g的比值为20-30，最优选80℃热水的用量ml与脱酯的辣木籽粉的质量g的比值为25。

上述技术方案中，可采用现有常规的方法对提取液脱蛋白，通常采用现有常规的sevage法对提取液脱蛋白。优选是先将提取液进行浓缩，然后再向浓缩液中加入sevage进行脱脱蛋白；通常是将提取液浓缩至膏状。

上述技术方案中，通常是向上清液中加入乙醇至体系中的醇浓度为80％(体积)进行醇沉。

与现有技术相比，本发明采用特定浓度乙醇对脱酯的辣木籽粉进行解吸后再用80℃热水进行提取的工艺，不仅使辣木籽中的硒及多糖能充分提取出来，同时使辣木籽中的硒活性成分有效地保持于提取液中，损失极少。整个工艺简单易操作且提取时间短。

以下是申请人以硒多糖中硒含量为考量指标确定本发明所述方法的最佳工艺的优化实验及验证实验。

1材料与方法

1.1材料与仪器

辣木籽由广西习缘辣木有限公司提供，硒标液、双氧水、铁氰化钾、葡萄糖、硫酸、苯酚、氢氧化钠、盐酸、高氯酸等为国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯试剂。

lgj-10c真空冷冻干燥机北京四环科学仪器厂有限公司；hr/t16台式高速冷冻离心机湖南赫西仪器装备有限公司；af-610e原子荧光光谱仪北京瑞利分析仪器有限公司；uv-1950紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程

辣木籽粉末→脱脂→解吸、提取→提取液→脱蛋白→醇沉→离心冷冻干燥→辣木籽硒多糖。

1.2.2实验步骤

1.2.2.1辣木籽脱脂处理

将辣木籽于40℃恒温干燥后粉碎，过100目分子筛，取所得辣木籽粉与石油醚按1g：3ml的固液比浸泡7天脱脂，减压蒸馏回收石油醚，收集油脂部分测硒含量；残余物置于通风处挥发溶剂后即得到脱脂的辣木籽粉，冰箱低温保存，备用。

1.2.2.2解吸、提取工艺

称取脱脂的辣木籽粉2.00g，加入一定体积(3、4、5、6、7)ml的解吸剂(50v/v％、60v/v％、70v/v％、80v/v％、90v/v％)乙醇解吸一段时间(10、15、20、25、30)min后，迅速加入一定温度(50、60、70、80、90)℃的提取剂(去离子水)50ml提取一定时间(3、4、5、6、7)min。提取两次，减压抽滤，收集合并两次提取滤液，即得到辣木籽多糖溶液。测定辣木籽多糖溶液中的硒含量。

1.2.2.3脱蛋白及醇沉

采用sevage法，将辣木籽多糖溶液浓缩至膏状后加入sevage试剂，充分搅拌30min，离心分离，收集上层清液；向上层清液加入乙醇至体系中乙醇的浓度为80％体积，醇沉，离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到辣木籽硒多糖。测定辣木籽硒多糖中的硒含量。

1.2.3硒多糖含量测定

根据gb5009.93-2010，采用氢化物原子荧光光谱法测定硒含量。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.3.1硒标准曲线的制作

精确移取(0.00,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50)ml硒标准溶液于25ml比色管中，用去离子水定容至10ml，摇匀后再分别加入2ml盐酸和1.0ml100g/l的铁氰化钾溶液，摇匀，按gb5009.93-2010采用氢化物原子荧光光谱法测定，绘制标准曲线。

1.2.3.2总硒含量测定

辣木籽加入硝酸充分浸泡，加入高氯酸进行消解完全后,按按gb5009.93-2010氢化物原子荧光光谱法测定辣木籽总硒，根据硒标准曲线计算总硒含量。

1.2.3.4辣木籽硒多糖提取液中硒含量测定

称取辣木籽硒多糖提取液0.5g，加入10ml硝酸、2ml过氧化氢，摇匀，在电热板上进行消化，至溶液约剩余2ml后，加入6mol/l盐酸5.0ml，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，冷却后将试样转移至25ml容量瓶中用6mol/l盐酸定容。同时做空白试验。取10.00ml消化液按1.2.3.1测定硒含量。硒含量计算公式按式(1)计算。

x—试样中硒含量，单位mg/kg；

c—试样消化液测定浓度，单位ng/kg；

c0—试样空白消化液测定浓度，单位ng/kg；

m—试样质量，单位g。

1.2.3.5多糖含量的测定

按文献(邱现创,赵宁,李晨,等.铁皮石斛多糖提取工艺优化及对果蝇抗氧化能力的影响[j].食品科学,2018,39(02):273-280.)采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。多糖提取含量按公式(2)计算。

m1——从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，单位为毫克(mg)；

m2——样品质量，单位为克(g)；

v1——样品定容体积，单位为毫升(ml)；

v2——比色测定时所移取的测定液体积，单位为毫升(ml)；

0.9——葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.2.4硒活性成分有效保持

辣木籽硒活性成分有效保持主要通过辣木籽提取前以及提取后硒总量变化进行考量。辣木籽总硒由油脂部分硒含量、提取后滤渣部分硒含量、提取液部分硒含量组成。

2结果与分析

2.1辣木籽总硒含量

根据1.2.3实验方法，得到辣木籽总硒含量为3.56mg/kg。而辣木籽经解吸、提取，得到的提取液经过脱蛋白、乙醇醇沉，所得辣木籽硒多糖中的硒含量为1.72mg/kg；说明辣木中提取多糖是含有硒的，因硒含量测定方法耗能大实验相对复杂，所以在优化提取工艺部分，以多糖提取含量进行考量。

2.2多糖标准曲线，

根据1.2.3.5进行实验，得回归方程为：y＝0.386x-0.0005,r²＝0.9998。所得多糖标准曲线如图1所示。根据标准曲线计算多糖含量。

2.3解吸、提取工艺

2.3.1解吸剂对辣木籽多糖提取的影响

由图2可知，辣木多糖含量随着解吸剂浓度的增大而增大，当解吸剂浓度达到80v/v％时，多糖含量最高，再增加解吸剂浓度，多糖含量并没有继续升高，而是呈下降趋势。原因可能是，根据有机物相似相容原理，60-80v/v％之间的乙醇浓度，能有效地将植物中有效成分充分溶出，乙醇浓度过高，多糖形成沉淀，解吸不充分。因此选择解吸剂为80v/v％乙醇。

2.3.2解吸剂体积对辣木籽多糖提取的影响

由图3可知，辣木籽多糖含量随着80v/v％乙醇的量增大而增大，当80％乙醇的量达到5.0ml后，多糖含量增加缓慢，原因可能是，解吸剂用量少，辣木籽样品内部得不到充分浸润，解吸不充分，提取效果差，当解吸剂用量达到5.0ml后，样品得到充分渗透，解吸充分，提取效果高，而解吸剂体积继续增加，多糖含量变化不大，原因是解吸剂用量在5.0ml时，已经充分解吸，绝大部分多糖已经溶出，继续增加解吸剂用量，多糖含量趋于平稳。因此选择解吸剂体积为5.0ml。

2.3.3解吸时间对辣木籽多糖提取的影响

由图4可知，随着解吸时间不断加长，辣木籽多糖含量不断增加，当解吸时间到达25min后，多糖含量最高，再增加时间，多糖含量并没有明显变化，原因可能是25min之前，乙醇溶液没有充分渗透样品内部，解吸不充分，25min之后，解吸充分，辣木籽多糖已基本溶出，多糖含量趋于稳定。因此选择解吸时间为25min。

2.3.4提取温度对辣木籽多糖提取的影响

由图5可知，随着提取温度的增加，辣木籽多糖含量不停地增加，当提取温度达到80℃时，多糖含量最高，继续升高温度，多糖含量反而下降了。原因可能是：温度较低，多糖溶出较为困难，从而影响提取效果；而温度较高，多糖也会因其热不稳定性而产生分解同时，温度过高，物料内部沸腾激烈，分子扩散时间短，辣木籽多糖有效成分还来不及溶出，而提取过程已结束，从而导致提取率下降，因此选择提取温度为80℃。

2.3.5提取时间对辣木籽多糖提取的影响

由图6可知，辣木籽多糖含量随着提取时间的增加而增加，当提取时间到达6min辣木多糖含量最大，之后多糖含量趋于稳定。原因可能是提取时间短，物料内部分子扩散不完全提取过程就结束了，导致多糖含量不高，提取时间6min时，提取过程充分，多糖含量基本已溶出，继续增加时间，多糖含量并没有明显增加。因此选择提取时间为6min。

3验证实验

称取脱脂的辣木籽粉2.00g，加入5.0ml80v/v％乙醇溶液解吸25min后，迅速加入温度80℃的去离子水50ml提取6min。平行三次实验。油脂部分未检测出硒，提取液即辣木籽多糖溶液中的硒含量结果如下述表1所示。

表1：验证实验结果

由表1可以看出，内部沸腾法提取辣木籽硒活性成分比较稳定，具有可行性。

4小结

通过上述试验得到提取辣木籽硒多糖的最优提取工艺为：解吸剂为80v/v％乙醇、解吸剂体积为5.0ml/g、解吸时间为25min，提取温度为80℃，提取时间为6min。

根据实验测定，辣木籽总硒含量为3.56mg/kg，提取液部分硒含量为3.07mg/kg，油脂部分中未检测出硒。辣木籽硒提取率为86.2％。可见，本发明所述方法提取辣木籽硒有效成分工艺操作简单、快捷，能使辣木籽中硒活性成分有效保持，损失少。是一种值得推广的硒活性成分有效保持的提取技术。

附图说明

图1为多糖标准曲线；

图2为解吸剂浓度与辣木籽多糖含量的关系曲线；

图3为解吸剂体积与辣木籽多糖含量的关系曲线；

图4为解吸剂时间与辣木籽多糖含量的关系曲线；

图5为提取温度与辣木籽多糖含量的关系曲线；

图6为提取时间与辣木籽多糖含量的关系曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例中所用原料辣木籽中的总硒含量均为3.56mg/kg。

实施例1

1)取辣木籽于40℃恒温干燥后粉碎，过100目分子筛，将所得辣木籽粉与石油醚按1g：3ml的固液比浸泡7天脱脂，减压蒸馏回收石油醚，残余物置于通风处挥发溶剂后即得到脱脂的辣木籽粉；

2)取2g脱脂的辣木籽粉置于烧瓶中，按5.0ml/g的料液比加入80v/v％乙醇解吸25min，然后立即加入50ml80℃热水提取6min，抽滤，滤渣重复上述提取操作一次，合并滤液，即得到104.5ml辣木籽多糖溶液；按前述1.2.3所述方法测定(下同)辣木籽多糖溶液中的硒含量，为3.07mg/kg；

3)所得辣木籽多糖溶液浓缩至膏状，然后向其中加入sevage试剂，充分振荡、搅拌30min，离心分离，收集上层清液；向上层清液加入乙醇(加入乙醇直至料液中醇含量为80％体积)醇沉，离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到0.2087g辣木籽硒多糖，经测定，辣木籽硒多糖中的硒含量为1.72mg/kg。

对比例1

1)同实施例1的步骤1)；

2)取2g脱脂的辣木籽粉置于烧瓶中，按5.0ml/g的料液比加入100℃沸水浸提6min，抽滤，滤渣重复上述提取操作一次，合并滤液，即得到99ml辣木籽多糖溶液；测定辣木籽多糖溶液中的硒含量为2.65mg/kg；

3)同实施例1的步骤3)。最后得到0.1968g辣木籽硒多糖。

对比例2

称取2.0g已经过脱油脂的辣木籽粉于250ml烧杯中，加入50ml蒸馏水后，将瓶口密封，置于振荡器上设置温度80℃振摇4h后，减压抽滤，滤渣重复上述浸提操作一次，合并两次滤液，得到提取液。经测定，提取液中的硒含量为2.79mg/kg。

实施例2

1)取辣木籽于40℃恒温干燥后粉碎，过100目分子筛，将所得辣木籽粉与石油醚按1g：5ml的固液比浸泡5天脱脂，减压蒸馏回收石油醚，残余物置于通风处挥发溶剂后即得到脱脂的辣木籽粉；

2)取2g脱脂的辣木籽粉置于烧瓶中，按6.0ml/g的料液比加入80v/v％乙醇解吸30min，然后立即加入50ml80℃热水提取7min，抽滤，滤渣重复上述提取操作一次，合并滤液，即得到106ml辣木籽多糖溶液；

3)所得辣木籽多糖溶液浓缩至膏状，然后向其中加入sevage试剂，充分振荡、搅拌30min，离心分离，收集上层清液；向上层清液加入乙醇(加入乙醇直至料液中醇含量为80％体积)醇沉，离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到0.2071g辣木籽硒多糖。

实施例3

1)取辣木籽于40℃恒温干燥后粉碎，过100目分子筛，将所得辣木籽粉与石油醚按1g：4ml的固液比浸泡6天脱脂，减压蒸馏回收石油醚，残余物置于通风处挥发溶剂后即得到脱脂的辣木籽粉；

2)取2g脱脂的辣木籽粉置于烧瓶中，按5.0ml/g的料液比加入80v/v％乙醇解吸25min，然后立即加入40ml80℃热水提取7min，抽滤，滤渣重复上述提取操作一次，合并滤液，即得到85.5ml辣木籽多糖溶液；

3)所得辣木籽多糖溶液浓缩至膏状，然后向其中加入sevage试剂，充分振荡、搅拌30min，离心分离，收集上层清液；向上层清液加入乙醇(加入乙醇直至料液中醇含量为80％体积)醇沉，离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到0.1964g辣木籽硒多糖。

实施例4

1)取辣木籽于35℃恒温干燥后粉碎，过100目分子筛，将所得辣木籽粉与石油醚按1g：3ml的固液比浸泡5天脱脂，减压蒸馏回收石油醚，残余物置于通风处挥发溶剂后即得到脱脂的辣木籽粉；

2)取2g脱脂的辣木籽粉置于烧瓶中，按5.5ml/g的料液比加入80v/v％乙醇解吸27min，然后立即加入60ml80℃热水提取6min，抽滤，收集滤液，即得到120.5ml辣木籽多糖溶液；

3)所得辣木籽多糖溶液浓缩至膏状，然后向其中加入sevage试剂，充分振荡、搅拌30min，离心分离，收集上层清液；向上层清液加入乙醇(加入乙醇直至料液中醇含量为80％体积)醇沉，离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得到0.2080g辣木籽硒多糖。