本发明涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断迟发型感音神经性耳聋中应用的diaph1基因单个突变位点c.3575-2a>g分型检测试剂盒。
背景技术：
：diaph1是1997年lynch等确定dfna1型耳聋致病基因。20年来已有数个diaph1基因突变引起的遗传性耳聋家系被报道，大多数患者表现为迟发性听力损失伴或不伴血液学异常。此外，还发现diaph1基因突变与常染色体隐性遗传小头综合征相关。遗传性耳聋具有明显的表型多样性和遗传异质性。diaph1基因(omim:602121)全称diaphanousrelatedformin1，其他名称有：dia1、drf1、dfna1、lfhl1、scbms、hdia1，定位于5q31.3，基因组位置chr5:141,515,021-141,619,055,全长104035bp，cdna含28个外显子。由于剪接位点的不同，人类diaph1基因有3种不同的转录异构体(transcriptvariants)，包括isoform1、isoform2、isoform3。其中，isoform1编码的蛋白质最长，常作为diaph1基因编码dna的标准序列，其mrna全长5804bp，蛋白质编码区域在mrna的142bp～3960bp区域，编码含有1272个氨基酸的蛋白质。neuhaus等发现位于diaph1基因27号外显子的框移突变p.ala1210serfster31(c.3624_3625delag)和无义突变c.3637c>t(p.arg1213ter)同样引起了类似的diaph1-rd，并且详细分析了患者的听力损失特征，发现与以往diaph1突变引起低频听力损失不同，该突变患者表现为先天性中高频听力损失并且快速进展，部分患者伴中性粒细胞减少症和出血倾向。有研究使用免疫荧光技术研究了diaph1蛋白在小鼠耳蜗细胞及神经结构的分布，发现在耳蜗中的内柱细胞(ipc)、外毛细胞(ohc)基底部(可能为deiter细胞)、螺旋神经节神经元、蜗神经中心区域以及雪旺细胞和少突胶质细胞之间的交界区域都有diaph1蛋白的分布；推测上述突变可能影响肌动蛋白和微管的重构，导致内耳细胞和巨核细胞中细胞骨架和刚性结构发生改变，是耳聋伴随巨核细胞血小板减少症的机制之一，因此建议将血常规检查作为常染色体显性遗传性耳聋患者的常规检查项目，以帮助锁定具有综合征样表型特征的diaph1基因突变。同样的无义突变和类似综合征样表型也见于ganaha等的报道，该文提出位于dad结构域的突变位点c.3637c>t(p.arg1213ter)是该基因的热点突变位点；不同的是该文中家系患者的血小板数量比strilt等的报道更少，且随着年龄增长而减少，因此推测血小板减少也是渐进性的；文中指出myh9相关性综合征如：may-hegglinanomaly(omim155100)、fechtnersyndrome(omim153640)、epstainsyndrome(omim153650)、sebastiansyndrome(omim606249)也表现为听力损失及mtp，因此，建议有diaph1-rd的患者需要同时检测diaph1和myh9基因。但常染色体显性遗传性耳聋伴血小板减少症的分子机制目前尚未明确。diaph1基因突变可引起常染色体显性遗传的迟发性感音神经性耳聋伴或不伴血液学异常及常染色体隐性遗传性小头综合征。作为dfna1型耳聋的致病基因，以往认为diaph1基因突变主要与低频遗传性耳聋相关，儿童期发病，30岁左右发展至重度到极重度全频听力损失；近年来一些文献也报道该突变也可引起中高频听力损失，体现了常染色体显性遗传性耳聋的表型多样性。但多数文献中家系患者例数较少，受环境等因素影响较大，无法确定听力损失特征的可靠性。目前尚未见关于diaph1基因nm_001314007:c.3575-2a>g突变的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种迟发型感音神经性耳聋致病基因diaph1突变检测试剂盒。为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种用于检测diaph1基因c.3575-2a>g突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增dna片段的pcr反应试剂，所述pcr反应试剂包括pcr引物，该pcr引物扩增的目标片段包含人diaph1基因第27号外显子剪切位置nm_001314007:c.3575-2的碱基。优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取pcr扩增所需的模板dna的试剂。优选的，所述试剂盒还包括用于对pcr扩增的目标片段进行测序的试剂。优选的，所述pcr引物选自引物对p1，引物对p1的序列为：diaph1-f-1:5’-cttggagttgggcagttgta-3’；diaph1-r-1:5’-aaatgccaactcaaatccct-3’。优选的，所述pcr引物选自引物对p2，引物对p2的序列为：diaph1-f-2:5’-ccctgctctgaaacctaacc-3’；diaph1-r-2:5’-tactctgtaacatgggaagaa-3’。利用上述试剂盒检测diaph1基因c.3575-2a>g突变的方法，包括以下步骤：1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取dna；2)以步骤1)提取的dna为模板，以上述pcr引物进行pcr反应，得到pcr反应产物；从pcr反应产物中分离pcr反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人diaph1基因第27号外显子剪切位置nm_001314007:c.3575-2的碱基进行分型鉴定。优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列(geneid:1729)进行比对，确定待测个体对应于人diaph1基因第27号外显子剪切位置nm_001314007:c.3575-2的基因型或等位基因类型。优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型a/a、突变杂合型a/g或突变纯合型g/g。上述试剂盒在迟发型感音神经性耳聋病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测来自于待测样本(患者的diaph1基因片段)中对应于人diaph1基因的第27号外显子剪切位置的碱基是否存在nm_001314007:c.3575-2a>g突变，从而判断该患者迟发型感音神经性耳聋发生的遗传性原因。其中，diaph1基因发生nm_001314007:c.3575-2a>g突变，导致diaph1基因的第27号外显子(根据nm_001314007序列)无法正常剪切，整个蛋白序列不能正常表达。本发明的有益效果体现在：本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测diaph1基因特定突变位点，通过检测来自患者的dna样本中是否存在diaph1基因c.3575-2a>g突变，可以判断该患者的迟发型感音神经性耳聋发生原因，进而为临床诊断提供依据。本发明所提出的试剂盒在用于迟发型感音神经性耳聋的诊断时：1)本发明将为在迟发型感音神经性耳聋患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)通过产前诊断筛查，明确胎儿是否携带c.3575-2a>g杂合突变，降低聋儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。附图说明图1为diaph1基因编码区氨基酸的保守性分析：突变位于diaph1基因第27号外显子剪切位置nm_001314007:c.3575-2，用方框圈起来的是突变前的碱基(反向序列中为t)。图2为pcr反应流程图：示出了反应条件(反应温度和时间)，其中↓表示每个循环降低0.5℃。图3a为待测个体diaph1基因测序结果图：示出了突变杂合型序列，箭头所指为突变位点位置。图3b为待测个体diaph1基因测序结果图：示出了野生型序列，箭头所指为突变位点位置。图4为扩增产物的电泳图谱：泳道1为marker，泳道2为扩增的目标序列(701bp)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。本发明应用候选基因筛查的方法对100例感音神经性耳聋患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一例迟发型感音神经性耳聋患者发现diaph1基因的nm_001314007:c.3575-2a>g突变(简称c.3575-2a>g突变)。该患者的听力学检测结果是迟发型感音神经性耳聋，ct和mri结果未显示异常，父亲、姑姑、奶奶均是迟发型感音神经性耳聋，患者的妹妹听力正常。患者的基因型是c.3575-2a>g杂合突变，父亲、姑姑携带c.3575-2a>g杂合突变，母亲、妹妹基因型属野生型，diaph1基因突变与迟发型感音神经性耳聋表型共分离。diaph1基因突变相关的迟发型感音神经性耳聋以常染色体显性遗传的方式传递。目前已经报道的与迟发型感音神经性耳聋相关的突变有很多种，尚无c.3575-2a>g突变的报道。diaph1基因c.3575-2a>g突变后，只引起了非综合征型迟发型感音神经性耳聋，而且患者之间表征差异较小。diaph1基因c.3575-2a>g突变对于迟发型感音神经性耳聋患者病因的明确具有重要的临床意义。上述突变(c.3575-2a>g,nm_001314007)使位于diaph1基因的第27号外显子剪切位置的碱基发生了改变，导致第27号外显子不能正常剪切，使整个蛋白不能正常表达。该位点在各个物种之间是高度保守的(图1)。在diaph1基因的各种转录异构体中都存在对应于这一影响第27号外显子剪切的突变(nm_001314007:c.3575-2a>g)。检测上述突变(c.3575-2a>g)可采用多种检测点突变的方法来进行，例如pcr(聚合酶链反应)-测序法、采用标记的diaph1基因dna探针杂交法、用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用pcr扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组dna；2)以该dna为模板，以针对diaph1基因第27号外显子剪切位置nm_001314007:c.3575-2设计的pcr引物进行pcr反应，得到pcr扩增产物；3)将得到的pcr扩增产物进行直接测序分析，将测序所得到的序列与diaph1基因参考序列(geneid:1729)进行比较，确定待测个体diaph1基因是否存在c.3575-2a>g突变；4)根据以上结果判断待测个体是否为diaph1基因突变c.3575-2a>g导致的迟发型感音神经性耳聋。在上述步骤2)中使用的pcr引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，gc含量为45～50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。上述步骤2)所得到的pcr反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的diaph1核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。根据检测方法的不同，用于检测diaph1基因c.3575-2a>g突变的试剂盒中，除了包括pcr反应试剂，还包括检测pcr扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。试剂盒容器内装有用以检测diaph1基因c.3575-2a>g突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于pcr反应试剂，例如，可含有扩增引物、dntps、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液等。实例1通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用蛋白酶降解法提取基因组dna，定量后入库，-20℃保存，每份dna样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件primer5.0设计引物(扩增目标区域为diaph1基因第27号外显子及其剪切位置，参考序列：geneid:1729，扩增目标片段大小为701bp)，以基因组dna为模板，bioradmycycle热循环仪上进行pcr扩增。pcr扩增产物直接测序：测序引物与pcr扩增引物相同，正反向测序，应用abi公司3730dna测序仪。测序得到的序列与genbank中的序列(geneid:1729)比较，确定diaph1c.3575-2a>g突变。具体如下：(一)待测血样提取与diaph1基因编码区的pcr扩增1、待测对象血样dna的制备1.1研究对象对100例散发感音神经性耳聋患者和100名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行diaph1基因的筛查。散发感音神经性耳聋受试者采集自在西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科门诊做耳聋基因筛查的耳聋患者。听力正常对照是无耳聋家族史的听力正常受试者，对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5～10ml，采集时间是2009年9月。1.2基因组dna提取1.2.1实验前准备及重要注意事项(1)向蛋白酶k中加入制定用量的proteinasekstoragebuffer使其溶解，-20℃保存。配制好的proteinasek(蛋白酶k)勿长时间室温存放，避免反复冻融，以免影响其活性。(2)所有离心操作均在室温下完成。(3)血样样品的储存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例如southern杂交等，需要得到完整全长的基因组dna，将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组dna的降解程度较轻。1.2.2操作步骤1)低速离心至血样分层，用移液枪去除上层血清，注意不要吸取或损坏中间层的黄膜层。2)将全部血细胞转移至5ml离心管中，加入红细胞裂解液至总体积为4ml，上下颠倒混匀20次至沉淀充分分散。3)6500g离心10min，弃去上清。4)加入3mlbufferfg1，涡漩振荡15s，使沉淀充分分散。5)6500g离心10min，弃去上清，将离心管倒扣在干净的吸水纸上，吸干水分。6)配制dna提取液与蛋白酶k的混合液，混合比例为dna提取液:蛋白酶k＝100:1，混合后涡漩振荡15s充分混匀，按需配制，现配现用。7)向样品中加入配制好的dna提取液与蛋白酶k的混合液1ml，立即充分涡漩振荡1min，直至溶液无团块。8)将样品置于65℃水浴锅中温育15min，其间颠倒混匀3次，至样品颜色从红色变成淡绿色，说明蛋白完全消化。9)向样品中加入2ml异丙醇，颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。10)取干净无菌的1.5ml离心管，做好标记，加入500μl预冷的75％乙醇。11)用干净无菌的1ml移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10)中准备好的75％乙醇中，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，注意不要倒掉白色絮状沉淀。11)再次加入500μl预冷的75％乙醇，颠倒混匀10次，缓慢倒掉上清，吸干。12)打开管盖，室温干燥15min，至所有液体完全挥发。13)加入380μldna溶解液，置于65℃水浴/金属浴中温育2h，同时进行振荡使dna充分溶解。14)分光光度计定量及检测纯度。15)-20℃保存dna。2、diaph1基因编码区的pcr扩增2.1引物序列使用primer5引物设计软件，参考序列(geneid:1729)，序列合成后用于此检测，设计完成时间为2018年9月：上游引物diaph1-f-1:5’-cttggagttgggcagttgta-3’；下游引物diaph1-r-1:5’-aaatgccaactcaaatccct-3’。使用该引物进行pcr扩增所获得的片段大小为701bp。2.2pcr反应体系的建立(表1)表1.diaph1基因的pcr反应体系其中，pcr扩增使用天根公司pcrmix。反应条件：pcr反应在bioradmycycle热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示。pcr产物电泳流程：1)配胶(1％琼脂糖)：称取0.4g琼脂糖，悬浮于40ml×tae中(500ml锥形瓶)。2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴eb(约10μl，10mg/ml)，摇匀。4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×tae，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。6)加样：用移液器按规定格式加样，最后加入markerdl2000。7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相。经过电泳后，有6条带可见，markerdl2000(takara)片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，dl2000的总浓度是300ng/5μl。电泳时取5μldl2000，因此每条带的含量为50ng。pcr产物电泳时取5μl(pcr产物)进行电泳。根据pcr产物电泳后的灰度值与dl2000的灰度值的比较判断pcr产物的大小及含量(参见图4)。(二)diaph1基因编码区pcr扩增产物的纯化和定量pcr扩增产物的纯化(96孔板法)：1)pcr扩增产物电泳结束后，在长波365nm紫外透射仪下，用手术刀切下目的条带，切取的胶块质量应小于3g，将其放入对应的板孔号中。2)4000rpm离心1min，加入500ul溶胶液，盖上封口膜，65℃水浴15min，定时。3)检查每孔胶块是否完全溶解，若没有完全溶解再次65℃水浴3min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入10μl混匀的磁珠，盖上硅胶垫，漩涡震荡30s，转入水平震荡仪600～800rpm震荡5min。4)将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。5)弃废液，吸水纸上轻磕，用50～1200μl8道电动移液器向每孔移入500μl洗液，盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。6)弃废液，吸水纸上轻磕，用50-1200μl8道电动移液器向每孔移取500μl70％乙醇盖上硅胶垫漩涡震荡30s，将96孔板卡入磁力架中，磁吸30s，将磁力架和样品正反轻微颠倒3次，再次静置磁吸1min。7)弃废液，吸水纸上轻磕，倒离心至600rpm水平震荡5min。8)离心至1000rpm，将96孔板卡入磁力架中，磁吸1min。9)2μl样品+6μl1.4x溴酚蓝混合后点入0.8％的鉴定胶中，按照a01-h01的竖向顺序横向点入，中间空出2孔，分别加入1μl、2μl量的dl2000，300v电泳11min。10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像，图像必须保证marker条带清晰。11)对照纯化前后胶图，根据pcr定量标准在pcr记录表上标注每孔扩增产物纯化后所得测序模板的浓度并稀释至指定浓度，对回收后电泳无条带的样品按照4μl样品+5μl1.4x溴酚蓝再次电泳鉴定。12)将稀释后上述模板离心2min，离心至4000rpm，标记lims系统模板状态，确认提交前需要再次核对上述模板状态，确认无误后将上述模板4℃冰箱保存。(三)纯化的diaph1基因编码区pcr扩增产物的直接测序1、pcr产物dna模板的纯度与用量要求见表2。dna纯度：od260/od280＝1.6～2.0。dna浓度：pcr产物10ng/μl。表2.dna用量pcr产物长度(bp)测序反应加入模板量(ng)100～2001～3200～5003～10500～10005～201000～200010～40>200040～1002、测序反应1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如96孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。3)目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量如表3所示。表3.diaph1基因pcr扩增产物的测序反应体系其中，bdt为美国应用生物系统公司(abi)生产的用于测序反应的荧光染料。5×gcbuffer是美国应用生物系统公司(abi)生产的用于测序反应的缓冲液。4)样品放于pcr仪(热循环仪)上，所作反应的过程见表4。表4.diaph1基因pcr扩增产物的测序反应过程5)反应完的样品要及时从pcr仪(热循环仪)上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。3、测序反应物的纯化和测序1)向每孔中加入20μl80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；2)在每孔中加入30μl70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；3)重复步骤2)再两次；4)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；5)加入5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；6)上机前95℃变性5min，放置冰上2min，离心后上abi3730测序仪。测序结果如图3a、图3b所示。(四)检测耳聋相关基因diaph1突变位点(c.3575-2a>g)试剂盒及其应用1、试剂盒的组成(1)扩增用引物：上游引物diaph1-f-1:5’-cttggagttgggcagttgta-3’下游引物diaph1-r-1:5’-aaatgccaactcaaatccct-3’(2)pcr扩增用pcrmix2×(4)dntp2.5mm(5)big-dyemix(美国应用生物系统公司(abi)生产)2、使用方法主要包括如下步骤：1)pcr扩增用软件primer5.0对diaph1基因的编码区设计pcr引物，反应条件见图2。2)pcr产物纯化pcr产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。3)测序反应及验证以pcr引物作为测序引物进行测序反应，在bioradmycycle热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于abi3730dna序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与正常序列(geneid:1729)比较，以确定突变是否存在。100例患者中，1例迟发型感音神经性耳聋患者的diaph1基因检测发现为c.3575-2a>g杂合突变。对100名听力正常者的筛查中未发现c.3575-2a>g突变者。实例2扩增引物(设计完成时间2018年9月)如下，其他同实例1(扩增的目标区域为diaph1基因第27号外显子及其剪切位置，参考序列：geneid:1729)：上游引物diaph1-f-2:5’-ccctgctctgaaacctaacc-3’，下游引物diaph1-r-2:5’-tactctgtaacatgggaagaa-3’。<110>中国人民解放军第四军医大学<120>迟发型感音神经性耳聋致病基因diaph1突变检测试剂盒<160>4<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1cttggagttgggcagttgta20<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2aaatgccaactcaaatccct20<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成<400>3ccctgctctgaaacctaacc20<210>4<211>21<212>dna<213>人工合成<400>4tactctgtaacatgggaagaa21当前第1页12