一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物防治技术领域，涉及一种番茄病毒病的微生物防治技术，具体尤其涉及一株抑制烟草花叶病毒(tobacomosaicvirus,tmv)和番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirus,tylcv)的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)及其应用。

背景技术：

植物病毒病素有“植物癌症”之称，是继植物真菌病害之后第二大植物病害，给农业生产造成了重大经济损失。植物病毒种类繁多，其中烟草花叶病毒(tomatomosaicvirus，tmv)是引起番茄和烟草等茄科植物的主要毒源之一。近年来，番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)在我国迅速传播，并呈逐年增长的趋势，对我国番茄生产构成严重威胁。长期以来，防治植物病毒病以化学防治和培育抗病毒品种为主，在化学药剂防治方面，目前令人满意的抗植物病毒剂实用化品种还不多，尤其特效的治疗性药剂更少，所报道的药剂在田间实际应用防效不理想，而且化学防治也存在着许多的问题，大量施用化学农药，造成农药残留、食品安全、生态环境污染等问题。所以培育抗病毒品种被认为是防治烟草花叶病毒病的经济而有效的途径。但是有限的具有商业价值的抗性材料大大限制了育种工作的进展，目前尚无优质高抗的品种可以大面积推广。随着植物病毒病的危害加重，化学农药的长期大量使用，环境污染、农药残留等问题，开发新的、高效、安全的微生物制剂来控制植物病毒病，已经成为农业安全及可持续发展的需要。

微生物代谢产生的抗病毒活性物质具有活性强、安全、效率高的优点，从微生物资源中筛选、分离获得多糖、核酸、蛋白质和小分子等抗病毒物质已成为当今研究的热点。有的已经形成产品，在农业生产中发挥重要作用，其中香菇多糖现已在中国成功登记为抗病毒剂，已工业化生产。尤其是抗病毒型农用抗生素的研制已取得了突破性进展，宁南霉素和嘧肽霉素是研究最成功的是抗病毒型农用抗生素。宁南霉素分离自诺尔斯链霉菌西昌变种，是一种新型胞嘧啶核苷类抗生素，具有广谱和高效的抑制作用，并且低毒、低残留等优点，已广泛应用于农业生产，其对tmv感染的防效为500μg/ml的浓度为58.1％。据报道，宁南霉素可诱导植物增加抗tmv活性。从吸水链霉菌分离得到的嘧肽霉素显示出有效的抗植物病毒活性，并已在中国成功登记和工业化为抗植物病毒剂。而其他大部分抗植物病毒活性物质和生防菌株均处于实验室研究阶段，因此，生产上尚缺少用于防治植物病毒病的新型微生物农药。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一株无毒、无致病性，对人畜安全、对环境友好，抗逆性强、抑菌活性稳定的抑制植物病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌，并将其应用于防治植物病毒病和植物真菌病害、促进植物生长等方面，实现了高效抑制病毒、促进植物生长，不破坏自然环境的目的，进而实现了可持续、和谐发展。

一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌的名称为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)snb55，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17315，保藏日期为2019年3月8日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

作为一种优选的方案，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55的菌株培养特征为在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上菌落呈白色至乳白色，近圆形，粗糙且边缘不规则，不透明，表面有褶皱，质地粘、质状；液体培养后，静置可在所述液体表面形成白色薄膜，所述液体内浑浊均匀、不结块。

更为优选的是，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55的菌株形态特征为菌体呈杆状，大小为(0.5～0.6)μm×(1.5～3.2)μm，聚合在一起呈短链或念珠状排列，有鞭毛，能运动；革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生、孢囊膨大，无伴孢晶体。

更为优选的是，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55的最适宜生长温度为26～28℃。

更为优选的是，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55的发酵产物能够抑制植物病毒和植物病原菌；所述植物病毒和植物病原菌包括烟草花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、蜡状芽孢杆菌、黄瓜枯萎病菌、烟草靶斑病菌、辣椒疫霉菌、水稻纹枯病菌和番茄灰霉病菌。

更为优选的是，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55能够分泌吲哚乙酸，促进种子萌发和植物生长。

更为优选的是，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55及其发酵产物无毒、无致病性，对人畜安全、对环境友好，抗逆性强、抑菌活性稳定。

一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55在防治植物病毒病和植物真菌病害中的应用。

作为一种优选的方案，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55在促进植物生长中的应用。

更为优选的是，所述抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55应用于防治烟草花叶病毒病、番茄黄化曲叶病毒病、黄瓜枯萎病、烟草靶斑病、辣椒疫病、水稻纹枯病和番茄灰霉病。

本发明的有益效果在于：本发明提供的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌及其应用具有以下优点：

①提供的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55及其发酵产物无毒、无致病性，对人畜安全、对环境友好，抗逆性强、抑菌活性稳定，是一株多功能生防菌，具有广阔的应用前景。

②提供的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55及其发酵产物能够广谱的抑制植物病毒和植物病原菌，其中包括烟草花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、蜡状芽孢杆菌、黄瓜枯萎病菌、烟草靶斑病菌、辣椒疫霉菌、水稻纹枯病菌和番茄灰霉病菌。特别是对烟草花叶病毒和番茄黄化曲叶病毒均具有较强的抑制作用，将其发酵液制备成生防水剂，幼苗期喷施、灌根、包衣种子对烟草花叶病毒和番茄黄化曲叶病毒引起的番茄病毒病具有很好的防治效果。

③提供的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55可分泌吲哚乙酸(iaa)，促进番茄种子发芽、生根和幼苗生长。

④提供的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55增加了防治植物病毒病的微生物抗病毒剂的种类。

附图说明

图1是本发明的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55的菌落形态图；

图2是本发明的一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌snb55发酵液和发酵滤液对蜡状芽孢杆菌的抑菌圈图；

图3是本发明实施例中盆栽试验测定发酵滤液在心叶烟上对tmv的抑制作用试验中接种tmv缓冲液的对照组心叶烟；

图4是本发明实施例中盆栽试验测定发酵滤液在心叶烟上对tmv的抑制作用试验中snb55发酵滤液与2倍tmv缓冲液混合后接种心叶烟；

图5是本发明的实施例中发酵滤液对番茄种子及幼苗生长影响的检测中对照组2种子生根情况；

图6是本发明的实施例中发酵滤液对番茄种子及幼苗生长影响的检测中实验组2种子生根情况；

图7是本发明的实施例中发酵滤液对番茄种子及幼苗生长影响的检测中对照组3幼苗生长情况；

图8是本发明的实施例中发酵滤液对番茄种子及幼苗生长影响的检测中实验组3幼苗生长情况。

附图标记：1-发酵液抑菌圈，2-发酵滤液抑菌圈。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一株抑制病毒、促进植物生长的贝莱斯芽孢杆菌，该菌株名称为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)snb55，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17315，保藏日期为2019年3月8日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

1.菌株培养

(1)培养基组成

平板、斜面培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，ph7.0～7.2。

发酵培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000ml，ph7.0～7.2。

蜡状芽孢杆菌培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨3g，na2hpo40.1g，琼脂18～20g，加蒸馏水至1000ml，ph7.8～8.0。

(2)贝莱斯芽孢杆菌snb55培养及发酵滤液制备

斜面培养：将菌株snb55转接至新鲜的斜面培养基上，28℃条件下培养1d，得到成熟斜面孢子；

发酵培养：在无菌条件下，将前述成熟斜面孢子以5％接种量接种至装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在28℃、转速150r/min的旋转式摇床上振荡培养46h，得发酵液；

无菌发酵滤液制备：将前述发酵液在10000r/min的条件下离心20min，收集上清，用的细菌过滤器过滤，得到无菌发酵滤液。

2.菌株检测

(1)检测项目及方法

1)菌落形态检测：将菌株snb55在平板培养基上分区划线，28℃培养5d，观察单菌落形态。

2)菌株snb55抑制蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)活性检测：将含有10⁹cfu/ml的蜡状芽孢杆菌的菌悬液700μl与70ml融化的蜡状芽孢杆菌培养基混合后倒入方盘中制成平板，在一个牛津杯中加入200μl前述发酵液，在另一牛津杯中加入200μl前述无菌发酵滤液，28℃培养16h后测量抑菌圈直径。

3)盆栽试验测定发酵滤液在心叶烟上对tmv的抑制作用：采用汁液摩擦接种法，人工接种tmv于盆栽的健康心叶烟上测定发酵滤液对tmv的抑制作用，实验分为4个实验组和1个对照组，每组30株，重复3次，具体处理方法见下表1。接种5d后调查枯斑数，计算病斑抑制率。

表1盆栽试验测定发酵滤液在心叶烟上对tmv的抑制作用实验分组处理方法

4)盆栽试验测定发酵滤液在番茄上对tmv的抑制作用：番茄品种为l402，采用汁液摩擦接种法，人工接种tmv于盆栽的健康番茄叶片测定发酵滤液对tmv的抑制活性，实验分为3个实验组和1个对照组，每组30株，重复3次，具体处理方法见下表2。根据分级标准分别记录番茄发病情况，计算防治效果，并且施药后进行作物安全性调查。

表2盆栽试验测定发酵滤液在番茄上对tmv的抑制作用实验分组处理方法

分级标准：0级：无任何症状；1级：心叶的叶脉为明脉，1-2片真叶呈现花叶；3级：中上部叶片花叶；5级：多数叶片花叶，少数叶片畸形；7级：多数叶片为重花叶、畸形、皱缩；9级：几乎所有叶片为重花叶、畸形、皱缩，植株矮化较明显。

5)盆栽试验测定发酵滤液对番茄花叶病毒病的防效：番茄品种为l402，共设5个组，包括3个实验组和2个对照组。实验组1：番茄假植3d开始喷施稀释20倍的发酵滤液，间隔5d再喷施1次，共喷3次；实验组2：用稀释20倍的发酵滤液浸泡种子5h，正常种植；实验组3：番茄假植3d后用稀释20倍的发酵滤液灌根，每株10ml，间隔5d再灌1次，共灌3次；对照组1：喷清水；对照组2：喷氨基寡糖素(海岛素)。采用汁液摩擦接种法，在番茄5片真叶期摩擦接种tmv，在接种后20d根据番茄tmv病症状分级标准调查病株发病情况，计算各处理病情指数和防治效果。

番茄tmv病症状分级标准：0级：无任何症状；1级：心叶的叶脉为明脉，1-2片真叶呈现花叶；3级：中上部叶片花叶；5级：多数叶片花叶，少数叶片畸形；7级：多数叶片为重花叶、畸形、皱缩；9级：几乎所有叶片为重花叶、畸形、皱缩，植株矮化较明显。

6)盆栽试验测定发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病的防效：番茄品种为l402，共设3个组，包括1个实验组和2个对照组。实验组1：于番茄假植3d开始喷施稀释20倍的发酵滤液，间隔5d再喷1次，共喷3次；对照组1：喷清水；对照组2：喷氨基寡糖素(海岛素)。在第3次施药后将毒源室所饲养的带番茄黄化曲叶病毒的粉虱均匀释放到试验番茄植株上，进行传毒，保证每株番茄上10头以上，在发病后15d根据番茄黄化曲叶病毒病症状分级标准调查病株发病情况，计算发病株率，病情指数和防治效果。

表3番茄黄化曲叶病毒病症状分级标准

7)田间小区试验测定发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病的防效：番茄品种为l402，设置防虫网阻隔，共设5组，包括3个实验组和2个对照组，每组3个重复。实验组1：番茄定植3d后喷施稀释20倍的发酵滤液，间隔5d再喷1次，共喷3次；实验组2：用稀释20倍的发酵滤液浸泡种子5h，正常栽培；实验组3：番茄定植3d后用稀释20倍的发酵滤液灌根，每株10ml，间隔5d灌1次，共灌3次；对照组1：喷清水；对照组2：喷氨基寡糖素(海岛素)。处理10d后向棚内释放带tylcv的粉虱，全程不喷任何杀虫剂，发病后15d按番茄黄化曲叶病毒病症状分级标准调查，计算病情指数和防治效果。

8)发酵滤液对番茄种子及幼苗生长影响的检测：实验共设6组，包括3个实验组和3个对照组，每组3个重复；其中实验组1、实验组2和对照组1、对照组2用于对种子生长影响的检测；实验组3和对照组3用于对幼苗生长的影响的检测。

①对种子生长影响的检测

实验组1：发酵滤液浸泡番茄种子5h，之后将种子放入铺有湿润滤纸的无菌培养皿中，28℃保温培养，观察种子萌发情况；实验组2：稀释20倍的发酵滤液浸泡番茄种子5h，之后将种子放入铺有湿润滤纸的无菌培养皿中，28℃保温培养，观察种子萌发情况；对照组1：发酵培养基浸泡番茄种子5h，之后将种子放入铺有湿润滤纸的无菌培养皿中，28℃保温培养，观察种子萌发情况；对照组2：稀释20倍的发酵培养基浸泡番茄种子5h，之后将种子放入铺有湿润滤纸的无菌培养皿中，28℃保温培养，观察种子萌发情况。

②对幼苗生长的影响的检测

实验组3：稀释20倍的发酵滤液浸泡番茄种子5h，在28℃恒温箱中催芽，待种子发芽后，播种于培养钵中，置于温室中正常管理；对照组3：稀释20倍的发酵培养基浸泡番茄种子5h，在28℃恒温箱中催芽，待种子发芽后，播种于培养钵中，置于温室中正常管理。一个月后拔苗，清水洗净用吸水纸吸干后测量株高、根、地上部鲜重和地下部鲜重；称量鲜重后，将番茄放置在通风干燥箱中105℃杀青30min，75℃烘干至恒重后称量地上部和地下部干重。

9)snb55的广谱抑菌试验：取直径为5mm的水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草靶斑病菌、辣椒疫霉菌碟倒扣于pda平板中央，在距离该菌碟上下约2cm处，用沾有贝莱斯芽孢杆菌snb55的接种环划两条平行直线，28℃培养3d，观察抑菌情况。

10)snb55分泌吲哚乙酸(iaa)的测定：实验组样品的制备，将贝莱斯芽孢杆菌snb55接种于含有l-色氨酸(200mg·l^-1)的lb液体培养基中，28℃，180rpm摇床培养4d。取50μl菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μlsalkowski比色液(50ml35％hclo4+1ml0.5mfecl3)(libbert&risch,1969)。以加入iaa50μl(50mg·l^-1，上海生工生物工程有限公司，纯度＞99％)的标准液为对照组。实验组和对照组的白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌iaa。

(2)检测结果

1)菌落形态检测结果：在平板培养基上的菌株snb55菌落呈白色至乳白色，近圆形，粗糙且边缘不规则，不透明，表面有褶皱，质地粘质状，见图1；液体培养后，静置可在液体表面形成白色薄膜，液体内浑浊均匀，不结块，菌株形态特征为菌体呈杆状，大小为(0.5～0.6)μm×(1.5～3.2)μm，聚合在一起呈短链或念珠状排列，有鞭毛，能运动；革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生、孢囊膨大，无伴孢晶体。

2)菌株snb55抑制蜡状芽孢杆菌活性检测结果：菌株snb55的发酵液和无菌发酵滤液对蜡状芽孢杆菌均具有很强的抑制作用，具体结果见表4，抑菌圈情况见图2。

表4菌株snb55发酵液及无菌发酵滤液对蜡状芽孢杆菌的抑制效果

从表中可以看出，发酵液的处理抑菌圈直径达到22mm，抑菌圈清晰、透明，室温放置15d后观察，抑菌圈仍清晰、透明，大小无变化，说明菌株snb55的发酵液对蜡状芽孢杆菌抑制作用强，抑菌效果持久。发酵液和无菌发酵滤液对蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径大小无明显差异，说明抑菌活性物质主要是菌株snb55的发酵产物。

3)盆栽试验测定发酵滤液在心叶烟上对tmv的抑制作用试验结果：菌株snb55发酵滤液各种处理均能抑制tmv的侵染，减少心叶烟上枯斑数量，具体结果见表5，钝化作用见图3和图4。

表5菌株snb55发酵滤液在心叶烟上对tmv的抑制作用

从表5中可以看出，发酵滤液与tmv混合的处理对tmv的钝化作用最强，其枯斑抑制率高达94.75％；在接种前48h喷施的抑制率为84.99％，在接种前24h喷施的抑制率为80.70％；接种后24h喷施的抑制率为70.18％。接种前喷施的枯斑抑制率明显高于接种后喷施对tmv的抑制率，说明预防作用好于治疗效果，且提前48h喷施效果更好。

4)盆栽试验测定发酵滤液在番茄上对tmv的抑制作用试验结果：菌株snb55发酵滤液各种处理均对tmv有一定的抑制作用，具体结果见表6。

表6菌株snb55发酵滤液在番茄上对tmv的抑制作用

从表中可以看出，抑制病毒活性最强的是发酵滤液与tmv直接混合的处理，发酵滤液稀释20倍液对tmv的防效达80％；在接种前喷施的预防作用为62.40％，明显高于接种后喷施的治疗作用(50.71％)，且发酵滤液处理发病率的增长速度也相对较慢，番茄长势好，颜色绿，叶片伸展、肥厚。

5)盆栽试验测定发酵滤液对番茄花叶病毒病的防效试验结果：实验组1、实验组2、实验组3中番茄的病情指数显著降低，防效分别为63.25％、61.80％和66.51％，均高于对照组2，灌根处理防效>叶面喷施防效>种子包衣防效，具体结果见表7。且用发酵滤液处理的番茄长势好，颜色绿，茎秆较粗壮，而对照组的番茄植株矮小，叶片发黄。

表7菌株snb55发酵滤液对番茄花叶病毒病的防效

3)盆栽试验测定发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病的防效试验结果：snb55发酵滤液能抑制番茄黄化曲叶病毒侵染，从而减少番茄发病，具体结果见表8。

表8菌株snb55发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病的防效

从表可以看出，接种tylcv前用稀释20倍的发酵滤液处理对番茄黄化曲叶病毒病的防效为56.30％，对照组2的防效为43.20％，且能明显减少发病率。

4)田间小区试验测定发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病的防效试验结果：菌株snb55发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病具有较好的防治效果，且优于氨基寡糖素，具体结果见表9。

表9菌株snb55发酵滤液对番茄黄化曲叶病毒病田间小区防效

在番茄定植后35d左右开始发病，发病后15d调查，从表9可以看出，实验组1、实验组2、实验组3的番茄的病情指数显著降低，防效分别为52.86％、31.91％、56.31％，实验组的防效高于药剂对照组2，且灌根处理防效>叶面喷施防效>种子包衣防效，喷施菌株snb55发酵滤液的实验组明显发病较轻，植株长势高。

5)发酵滤液对番茄种子及幼苗生长影响的检测结果：

①对种子生长的影响：snb55发酵滤液原液能抑制种子萌发，菌株snb55发酵滤液稀释20倍液能促进番茄种子萌发、促进生根，具体结果见表10，种子生根情况见图5和图6。

表10发酵滤液对番茄种子生长影响检测结果

从表中可以看出，菌株snb55发酵滤液原液处理的种子比对照短42.86％，而发酵滤液稀释20倍处理的种子比对照提前萌发、提前生根、根系增多，当发酵稀释液处理的根长达到5cm时，比对照增长42.86％。

②对幼苗生长的影响：菌株snb55发酵滤液20倍稀释液具有促进幼苗生长的作用，具体结果见表11，幼苗生长情况见图7和图8。

表11菌株snb55发酵液对番茄幼苗的促生长作用

从表中可以看出用稀释20倍的snb55发酵滤液处理的番茄种子长成的幼苗，长势好，颜色浓绿，无论株高、根长、地上部鲜重/干重、地下部鲜重/干重等指标和长势等均明显优于对照，分别比对照增加12.07％、8.53％、23.77％、31.88％、16.22％、34.51％。

6)snb55的广谱抑菌试验结果：snb55对黄瓜枯萎病菌、烟草靶斑病菌、辣椒疫霉菌、番茄灰霉病菌和水稻纹枯病菌均具有一定的抑制作用，其中对烟草靶斑病菌抑制作用最强，其次是水稻纹枯病菌。

7)snb55分泌吲哚乙酸(iaa)的测定结果：菌株snb55菌悬液加入salkowski比色液后颜色变红色，表明菌株snb55可分泌iaa。

应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。