一种用于培养中胚层基质细胞的无血清培养基的制作方法

本发明涉及一种用于培养中胚层基质细胞的无血清培养基。
背景技术：
：中胚层是生物体进化到陆生的基本条件之一，它的出现是细胞命运决定过程中的一个里程碑，为动物体器官系统的结构发展、生理的复杂化和完备化提供了必要的基础。哺乳动物中有许多重要的器官来源于中胚层，包括心脏、血液、肾脏、肌肉、骨骼和脂肪。中胚层来源的干细胞，如造血干细胞、肌肉干细胞等是目前再生医学和组织工程中重要的种子细胞，在基础研究和临床治疗中有着广阔的应用前景。中胚层基质细胞是从成年人外周血中分离出来的成纤维样细胞，它们的形态、表面标记及其分化潜能与骨髓间充质干细胞(bm-msc)相似。目前，已有越来越多的体内外实验表明，中胚层基质细胞有间充质及其间充质以外谱系的分化潜能。目前，已有研究者使用犬的单克隆株进行试验，表明了存活的中胚层基质细胞表达骨钙素，通过其自体静脉移植后可以形成骨内衬细胞。另有试验证实，将兔的中胚层基质细胞与疏松磷酸钙可溶性底物相结合之后进行自体移植，结果发现在兔尺骨临界大小的骨缺损模型上可以增强骨再生，由此显示了中胚层基质细胞可以作为骨再生的循环成骨细胞的一种新资源。除此之外，还有报道指出人、兔、豚鼠、小鼠和大鼠的中胚层基质细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞、肌管和成纤维细胞。因为血液比骨髓更容易获得，使用外周血作为中胚层基质细胞潜在资源的优势十分明显。目前，大多数体外培养中胚层基质细胞的方案是在基础培养基中添加一定比例的血清。但是血清中的未知成分在各批次间差别较大，会对细胞培养产生不可预料的结果，而且病原体微生物可能由血清导入，如果用于临床会产生副作用。针对这一情况，2015年卫计委发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》中明确指出：除特殊情况外，应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆；如必须使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染；严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。因此，研制开发出适合中胚层基质细胞体外生长的无血清培养基，既能满足细胞培养的要求，又能避免临床应用上因使用血清带来的诸多不利因素。技术实现要素：本发明目的是针对现有技术存在的缺陷提供一种用于培养中胚层基质细胞的无血清培养基。本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：一种用于培养中胚层基质细胞的无血清培养基，该培养基主要由氨基酸、维生素、抗氧化剂、碱基及核苷、脂类及前体类和能量代谢类的物质组成。上述培养基采用三蒸水配制，具体配方如下：其中氨基酸成分为：l-丙氨酸含量为0.27～0.33mmol/l；l-精氨酸含量为0.9～1.1mmol/l；l-天冬氨酸含量为0.36～0.44mmol/l；l-胱氨酸含量为0.18～0.22mmol/l；l-半胱氨酸含量为0.54～0.66mmol/l；l-异亮氨酸含量为0.36～0.44mmol/l；l-亮氨酸含量为0.36～0.44mmol/l；l-赖氨酸含量为0.18～0.22mmol/l；l-甲硫氨酸含量为0.09～0.11mmol/l；l-脯氨酸含量为0.27～0.33mmol/l；l-丝氨酸含量为0.54～0.66mmol/l；l-苏氨酸含量为0.54～0.66mmol/l；l-色氨酸含量为0.09～0.11mmol/l；l-酪氨酸含量为0.18～0.22mmol/l；l-缬氨酸含量为0.72～0.88mmol/l。维生素为：生物素含量为7.2e-04～8.8e-04mmol/l；维生素d2含量为2.7e-04～3.3e-04mmol/l；叶酸含量为5.4e-02～6.6e-02mmol/l；维生素k3含量为5.4e-05～6.6e-05mmol/l；烟酰胺含量为1.8e-04～2.2e-04mmol/l；d-偏多酸钙含量为9.0e-04～1.1e-03mmol/l；吡哆醛含量为1.8e-04～2.2e-04mmol/l；核黄素含量为2.7e-04～3.3e-04mmol/l；硫胺素含量为2.7e-03～3.3e-03mmol/l；维生素e含量为1.8e-05～2.2e-05mmol/l；维生素b12含量为9.0e-04～1.1e-03mmol/l。抗氧化剂成分：亚硒酸钠含量为2.7e-03～3.3e-03mmol/l。无机盐成分：cacl2含量为0.27～0.33mmol/l；kcl含量为2.7～3.3mmol/l；mgso4含量为0.54～0.66mmol/l；nacl含量为115～141mmol/l；nahco3含量为12.6～15.4mmol/l；na2hpo4含量为0.9～1.1mmol/l；cuso4·5h2o含量为1.4e-05～1.8e-05mmol/l；feso4·7h2o含量为2.7e-03～3.3e-03mmol/l；znso4·7h2o含量为2.7e-03～3.3e-03mmol/l。碱基和核苷类：腺苷含量为2.7e-02～3.3e-02mmol/l；脱氧腺苷含量为3.6e-02～4.4e-02mmol/l；脱氧胞苷含量为3.6e-02～4.4e-02mmol/l；脱氧鸟苷含量为3.6e-02～4.4e-02mmol/l；次黄嘌呤含量为1.4e-02～1.7e-02mmol/l；尿苷含量为3.6e-02～4.4e-02mmol/l。脂类和前体类；不饱和脂肪酸含量为4.5e-04～5.5e-04mmol/l；吐温-80含量为1.8e-02～2.2e-02mmol/l。能量代谢类；d-葡萄糖含量为9～11mmol/l；丙酮酸钠含量为0.9～1.1mmol/l。其他添加黄芪多糖含量为1.8～2.2g/l；神经营养因子-3(nt-3)含量为108～132μg/l；血小板来源生长因子(pdgf)含量为54～66μg/l；转铁蛋白含量为18～22mg/l；玻连蛋白含量为90～110μg/l；层粘连蛋白含量为2.5～3g/l；酚红含量为12mg/l。将以上组分混合，即可得到培养中胚层基质细胞的培养基。本发明公开的用于培养中胚层基质细胞的培养基ph值保持在6.8～7.4，渗透压为280-330mosm/kg。本发明的有益效果：本发明的培养基适用于中胚层基质细胞的培养，具有成分简单、质量稳定、减少患者意外感染的优点，对于中胚层基质细胞的临床推广应用具有重要意义。附图说明图1为本发明4倍镜下中胚层基质细胞结构示意图；图2为本发明10倍镜下中胚层基质细胞结构示意图；图3-图7为本发明中胚层基质细胞培养至第3代后采用流式细胞仪检测结果示意图；图8为本发明p4代中胚层基质细胞采用茜素红染色后结果示意图；图9为本发明p4代中胚层基质细胞采用阿尔辛兰染色后结果示意图；图10为本发明p4代中胚层基质细胞采用油红o染色后结果示意图。具体实施方式实施例1：1000ml中胚层基质细胞培养基的制备称取l-丙氨酸(sigma)0.3mmol、l-精氨酸(sigma)1mmol、l-天冬氨酸(sigma)0.4mmol/l、l-胱氨酸(sigma)0.2mmol、l-半胱氨酸(sigma)0.6mmol、l-异亮氨酸(sigma)0.4mmol、l-亮氨酸(sigma)0.4mmol、l-赖氨酸(sigma)0.2mmol、l-甲硫氨酸(sigma)0.1mmol、l-脯氨酸(sigma)0.3mmol、l-丝氨酸(sigma)0.6mmol、l-苏氨酸(sigma)0.6mmol、l-色氨酸(sigma)0.1mmol、l-酪氨酸(sigma)0.2mmol、l-缬氨酸(sigma)0.8mmol、生物素(sigma)8×10-4mmol、维生素d2(sigma)3×10-4mmol、叶酸(sigma)6×10-2mmol、维生素k3(sigma)6×10-5mmol、烟酰胺(sigma)2×10-4mmol、d-偏多酸钙(sigma)1×10-3mmol、吡哆醛(sigma)2×10-4mmol、核黄素(sigma)3×10-4mmol、硫胺素(sigma)3×10-3mmol、维生素e(sigma)2×10-5mmol、维生素b12(sigma)1×10-3mmol、亚硒酸钠(sigma)3×10-3mmol、cacl2(sigma)0.3mmol、kcl含量为3mmol、mgso4(sigma)0.6mmol、nacl(sigma)128mmol、nahco3(sigma)14mmol、na2hpo4(sigma)1mmol、cuso4·5h2o(sigma)1.6×10-5mmol、feso4·7h2o(sigma)3×10-3mmol、znso4·7h2o(sigma)3×10-3mmol、腺苷(sigma)3×10-2mmol、脱氧腺苷(sigma)4×10-2mmol、脱氧胞苷(sigma)4×10-2mmol、脱氧鸟苷(sigma)4×10-2mmol、次黄嘌呤(sigma)1.5×10-2mmol、尿苷(sigma)4×10-2mmol、d-葡萄糖(sigma)10mmol、丙酮酸钠(sigma)1mmol、不饱和脂肪酸(sigma)5×10-4mmol、吐温-80(sigma)2×10-2mmol、黄芪多糖(sigma)2g、神经营养因子-3(nt-3)(sigma)120μg、血小板来源生长因子(pdgf)(sigma)60μg、转铁蛋白(sigma)20mg、玻连蛋白(sigma)100μg、层粘连蛋白(sigma)2.73g、酚红12mg，混合，加入800ml纯水搅拌混匀后，定容至1000ml。充分混匀后，调节ph值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。实施例2：中胚层基质细胞的分离及培养无菌条件下取正常志愿者外周血10～20ml，样本须在在12小时内进行分离：1、将实验所需试剂从冰箱取出放置半小时复温。2、将外周血用生理盐水进行1:1稀释；3、将稀释好的外周血沿管壁缓慢加入含ficollhypaque人淋巴细胞分离液上层(两者比例为1:1)，其相对密度为1.077g/l；4、梯度离心，500g/min×30min；5、取中间云雾状的白膜层细胞，用实例1配置的无血清培养液离心洗涤2次，每次300g/min，离心5min；6、弃上清，加入5ml上述培养基，移入t25培养基。7、贴壁5-7天后换液，倒出t25瓶中的细胞上清，补加5ml全培继续培养。8、培养至90％融合时，用含0.25％胰蛋白酶的消化液消化；9、用cd73磁珠对细胞进行分选；10、分选后细胞接种至培养瓶培养，结果如图1和图2所示。实施例3：中胚层基质细胞的鉴定上述实施例2中分选的中胚层基质细胞培养至第3代，进行流式鉴定，具体操作步骤如下：取第3代细胞，达到80％～90％融合时用胰蛋白酶/edta消化液消化，制成1×106/ml细胞悬液。分别加入鼠抗人单克隆抗体cd45-pe、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe、hla-dr各10μl，充分混匀，室温下反应30min，每管加入1.5mlpbs，1200r/min离心5min，弃上清，每管加入100μlpbs，流式细胞仪检测，结果如下表，以及图3-图7所示。表1：细胞表面分子标志cd90、cd73检测结果表表面分子标记阳性率hla-dr2.75％cd451.85％cd7398.0％cd9098.6％cd10598.1％实施例4中胚层基质细胞的分化成骨诱导与检测：取p4代中胚层基质细胞，细胞计数后分别以6×104个/孔的密度接种于6孔培养板中，24h后换用成骨诱导液，每3d换液，诱导2周后用茜素红染色，结果如图8所示。成软骨诱导与检测：取p4代中胚层基质细胞，细胞计数后分别以3×105个细胞置15ml离心管中，220g低速离心8min，使细胞形成微团。用成软骨诱导液+tgf-β3在离心管中培养，每间隔3d换液，诱导5周，4％多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水洗后用阿尔辛兰染色，结果如图9所示。成脂诱导与检测：取p4代中胚层基质细胞，细胞计数后分别以1×105/孔接种于6孔培养板中，常规培养基培养24h后更换为脂肪诱导液a开始诱导，3d后更换成脂诱导液b维持，24h后再更换成成脂诱导液a诱导，循环诱导3周后用油红o染色，结果如图10所示。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12