食管癌样本的内参miRNA及其应用的制作方法

本发明涉及mirna检测领域，具体而言，涉及食管癌样本的内参mirna及其应用。
背景技术：
：食管癌(esophagealcarcinoma,ec)是全世界高发的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年约有40万人死于本病，严重危害民众健康；食管癌发病具有明显的地区差异，我国是世界上食管癌高发地区之一，平均发病率约为22.14/10万，同期死亡率16.77/10万，居恶性肿瘤死亡率的第4位。食管癌具有抵抗放化疗、局灶复发或远端转移的特性，五年生存率约为15-25％。食管癌的早期症状多不典型，进展期以进行性吞咽困难为典型临床表现。mirna是一种广泛存在于真核生物、平均长度约22(19-24)个核苷酸的非编码小分子rna，通过结合靶信使rna(messengerrna，mrna)的3’非编码区，特异性抑制靶mrna，在基因表达转录后调控中发挥关键作用，与疾病密切相关，诸如各种癌症。就食管癌而言，目前的研究结果表明，mirna在食管癌的发生、发展和诊断治疗中发挥重要作用，有望通过mirna实现食管癌的早期诊断、预后/疗效监测甚至为食管癌的治疗提供新靶点。然而，尽管已取得一定进展，mirna在食管癌的研究与应用仍受到较大限制。每个mirna研究者都必须面对且十分棘手的问题在于在检测健康受试者和食管癌相关患者时，缺乏可靠的内参基因，导致样本间mirna的比较变得困难。另外，目前关于食管癌mirna的研究主要集中于欧美国家的白种人群，缺少适用于亚种人群，特别是中国人群的mirna内参。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供hsa-mir-423-5p作为食管癌样本的内参mirna的应用，所述内参mirna具有在正常受试者和食管癌患者中表达水平高、易于检测，且表达水平基本一致，适合均一化的优点，为食管癌诊断的优质内参mirna。本发明的第二目的在于提供一种食管癌诊断试剂和/或诊断试剂盒，所述诊断试剂和/或诊断试剂盒包括食管癌mirna标志物的检测试剂和前述内参mirna的检测试剂，该诊断试剂和/或诊断试剂盒包括优质内参mirna，有利于获得准确的诊断结果。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：hsa-mir-423-5p作为食管癌样本的内参mirna的应用。在一些具体的实施方式中，所述样本的受试者为亚洲人群，优选地，所述亚洲人群为中国人群。在一些具体的实施方式中，所述样本来自于无症状受试者或食管癌疑似患者。在一些具体的实施方式中，所述样本来自于治疗前的食管癌患者或治疗后的食管癌患者。在一些具体的实施方式中，所述样本为组织样本或体液样本，所述体液样本优选为血液样本，可选地，所述血液样本为血清样本或血浆样本。在一些具体的实施方式中，所述内参mirna用于目的mirna的标准化。在一些具体的实施方式中，所述应用包括：测定样本中目的mirna和内参mirna的绝对浓度，将目的mirna的绝对浓度和内参mirna的绝对浓度进行比较，获得标准化后的mirna浓度。本发明还涉及：一种食管癌诊断试剂和/或诊断试剂盒，所述诊断试剂和/或诊断试剂盒包括食管癌mirna标志物的检测试剂和内参mirna的检测试剂，所述内参mirna包括hsa-mir-423-5p。在一些具体的实施方式中，所述内参mirna还包括hsa-mir-16-5p。在一些具体的实施方式中，所述食管癌mirna标志物的检测试剂和内参mirna的检测试剂为适用于如下方法的试剂：实时荧光定量pcr、数字pcr、荧光染料法、共振光散射法、测序或生物质谱法。在一些具体的实施方式中，所述所述食管癌mirna标志物的检测试剂和内参mirna的检测试剂为适用于实时荧光定量pcr的试剂，包括扩增引物和taqman探针。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述hsa-mir-423-5p在食管癌及癌旁组织的表达无显著差异，在血清表达丰度高，同时，中国人群血清样本检测结果表明，hsa-mir-423-5p同样维持高丰度表达，同时正常受试者与食管癌患者的表达丰度一致，稳定性好。hsa-mir-423-5p可作为食管癌优质内参mirna，尤其适合中国人群乃至亚洲人群。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例2中hsa-mir-451a的qrt-pcr检测结果，其中，normal表示正常受试者，cancer表示食管癌受试者；图2为实施例2中hsa-mir-320a的qrt-pcr检测结果，其中，normal表示正常受试者，cancer表示食管癌受试者；图3为实施例2中hsa-mir-423-5p的qrt-pcr检测结果，其中，normal表示正常受试者，cancer表示食管癌受试者；图4为实施例3中hsa-mir-423-5p的qrt-pcr检测结果，其中，normal表示正常受试者，cancer表示食管癌受试者；图5为实施例4中hsa-mir-16-5p的qrt-pcr检测结果，其中，normal表示正常受试者，cancer表示食管癌受试者；图6为对比例1中hsa-mir-16-5p的qrt-pcr检测结果，其中，normal表示正常受试者，cancer表示食管癌受试者。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1本实施例旨在初步筛选获得候选食管癌内参mirna，具体筛选方法和结果如下所示：(1)选择下述7个mirna作为候选食管癌内参mirna：hsa-mir-361-5p、hsa-mir-186-5p、hsa-mir-26a-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-451a、hsa-mir-423-5p和hsa-mir-320a。(2)借助tcga(thecancergenomeatlas)数据库的数据源，考察前述7个mirna在食管癌组织及其癌旁组织的表达水平，结果表明，前述7个mirna在食管癌及癌旁组织中均没有显著差异。(3)借助mirna-seq数据库的数据源，考察前述7个mirna在血清中的表达量，结果表明，其中hsa-mir-361-5p与hsa-mir-186-5p在血清中的丰度过低，不适合作为内参mirna。(4)查阅文献发现，hsa-mir-26a-5p，hsa-mir-191-5p分别可以抑制或促进食管癌细胞的增殖和转移，不适合作为食管癌内参mirna。(5)通过前述筛选步骤，选取hsa-mir-423-5p、hsa-mir-451a和hsa-mir-320a用于后续验证。实施例2本实施例的目的旨在考察hsa-mir-423-5p、hsa-mir-451a和hsa-mir-320a在中国人群正常受试者和食管癌受试者样本中的表达丰度，以考察其是否适合作为食管癌内参mirna。其中，受试者由32例正常受试者和32例食管癌受试者组成，均选自中国人群；检测样本为血清，检测方法为qrt-pcr。具体检测步骤如下所示：(1)rna提取采用mirneasyserum/plasmakit(qiagen)提取血清rna，操作步骤如下：250μl血清样本离心(10,000rpm,5mins)去除细胞碎片，将200μl上清转移至新的除rna酶的离心管；加入1,000μlofqiazol裂解液，按照试剂盒提供的操作步骤，最终溶于30μl去除rna酶水，于-80℃冻存备用。(2)mirna逆转录采用mir特异茎环结构引物，利用taqmanmicrorna反转录试剂进行mirnas的逆转录，反应体系如表1所示。表1mirna逆转录反应体系mirna逆转录反应体系用量(μl)10xrtbuffer0.605xrtprimer1.2multiscribetmreverse0.42100mmdntps0.06rnaseinhibitor0.06rna1.2rnase-freeh2o2.46mirna逆转录的反应条件如表2所示，结束后反应产物于-20℃保存。表2mirna逆转录的反应条件温度时间16℃30min42℃30min85℃5min(3)qrt-pcr检测mirnas表达使用appliedbiosystems(abi)公司quantstudiodx仪器，进行qrt-pcr检测，每个样本重复两次。反应体系如表3所示。表3qrt-pcr反应体系qrt-pcr反应体系用量(μl)taqmansmallrnaassay(20x)0.5productionrtreaction3taqmanuniversalmastermixii，noung5rnase-freeh2o1.5qrt-pcr的反应条件如表4所示。表4qrt-pcr的扩增条件(4)qrt-pcr检测结果qrt-pcr方法检测hsa-mir-423-5p、hsa-mir-451a和hsa-mir-320a表达，具体检测结果如图1～3所示。根据图1-2所示结果可知，hsa-mir-451a和hsa-mir-320a在正常受试者和食管癌受试者的血清中丰度均高，但其表达量在两组不同的受试者中表现出显著差异(p＝1.19e-7，p＝8.99e-5)。而如图3所示，hsa-mir-423-5p在正常受试者和食管癌受试者的血清中丰度高，且正常受试者和食管癌受试者的两组数据集中，离散型小，在表达丰度上未表现出显著差异(p＝0.225)，因此，hsa-mir-423-5p适合作为食管癌mirna的内参基因。实施例3本实施例旨在扩大样本数量，进一步验证hsa-mir-423-5p在正常受试者与食管癌受试者样本的表达水平。其中，受试者由100例正常受试者和100例食管癌受试者组成，均选自中国人群；检测样本为血清，检测方法为qrt-pcr。具体检测步骤参见实施例2。具体检测结果参见图4。根据图4所示结果可知，在正常受试者与食管癌受试者血清中，hsa-mir-423-5p的表达水平基本一致，无显著差异(p＝0.18)，且表达丰度较高，适合作为食管癌mirna的内参基因。实施例4hsa-mir-16-5p作为血液内参常在欧美人群中使用。本实施例旨在验证hsa-mir-16-5p在欧美正常受试者与食管癌受试者样本的表达水平。其中，受试者由20例正常受试者和20例食管癌受试者组成，均选自欧美人群；检测样本为血清，检测方法为qrt-pcr。具体检测步骤参见实施例2。具体检测结果参见图5。根据图5所示结果可知，在正常受试者与食管癌受试者血清中，hsa-mir-16-5p的表达水平基本一致，无显著差异(p＝0.584)，且表达丰度较高，适合作为欧美食管癌mirna的内参基因。对比例1本对比例旨在考察现有食管癌内参hsa-mir-16-5p在中国人群正常受试者和食管癌受试者血清中的表达水平。其中，受试者由100例正常受试者和100例食管癌受试者组成，均选自中国人群；检测样本为血清，检测方法为qrt-pcr。具体检测步骤参见实施例2。具体检测结果参见图6。根据图6所示结果可知，hsa-mir-16-5p在正常受试者和食管癌受试者血清中的表达水平具有较显著差异(p＝1.05e-13)，不适合作为中国人群乃至亚洲人群的食管癌内参mirna。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12