用于指导降血脂用药的SNP位点检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于基因诊断
技术领域：
，具体涉及一种用于指导降血脂用药的snp位点检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：高脂血症又称高脂蛋白血症，俗称血脂过高、高血脂，是指涉及血液任何或所有脂类以及又或脂蛋白异常升高水平的情况，是血脂异常最常见的形式(其中包括任何异常脂质水平)。高脂血症分为“原发性”和“继发性亚型”。原发性高脂血症通常来自于遗传原因(例如在受体蛋白中的突变)，而继发性高脂血症的产生是由于其它的原因，如糖尿病。脂质和脂蛋白异常是在一般人群较常见的，并且被认为是心血管疾病的一个改变的危险因素、起于动脉粥样硬化对它们发生影响。此外，某些形式的高脂血症可能诱发急性胰腺炎。国家卫生与计划生育委员会2015年初发布的《中国居民营养与慢性病调查报告》显示，2012年中国成人血脂异常患病率40.40％，比较2002年的患病率水平出现大幅度增加，其中高胆固醇血症患病率4.9％，高甘油三酯血症的患病率13.1％，低高密度脂蛋白胆固醇血症的患病率33.9％。呈现为国民血脂异常的普遍暴露状态，这对我国血脂异常防治工作提出更为严峻的挑战。血脂异常(主要是高胆固醇血症)是心血管病的主要危险因素。心血管病已成为我国城乡居民第一位死亡原因，严重消耗医疗和社会资源，给家庭和社会造成沉重的疾病负担。国内外的研究及临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的，降低人群胆固醇水平，可明显减少心肌梗死、缺血性卒中事件和心血管死亡，显著改善心血管病患者的生活质量并有效降低疾病负担。根据中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)：临床调脂达标，首选他汀类调脂药物。起始宜应用中等强度他汀，根据个体调脂疗效和耐受情况，适当调整剂量，若胆固醇水平不能达标，与其他调脂药物联合使用。注意观察调脂药物的不良反应。他汀类药物是最为经典和有效的降脂药物,广泛应用于高脂血症的治疗。自1987年起,他汀开始应用于临床,对防范心脑血管事件很有效,处方量很大。他汀类药物为目前临床上应用最广泛的一类调脂药物。他汀类药物为hmg-coa还原酶抑制剂,而此酶是胆固醇体内生物合成途径中的一种限速酶,这样他汀类药物可以阻断hmg-coa向甲基二羟戊酸转化,使肝脏内胆固醇合成减少。由于肝内胆固醇含量下降,肝胆胞的ldl受体基因的抑制被排除,从而增加细胞膜上高亲和力的ldl受体的表达,导致血桨中ldl、idl大量摄入肝脏,血浆中ldl-c水平下降,由于肝内胆固醇合成减少vldl的合成也减少,从而抑制ldl的生成。临床应用的数据统计显示单独使用他汀类药物时安全性均较高。而和其他,药物混合使用时,偶合事件发生率显著增加。横纹肌溶解症是他汀类药物的一种最为常见也是最严重的副作用。肌毒性随着单一他汀类药的剂量增加而发生率增高。联合用药是他汀类药相关性肌损害的一个重要原因。研究表明，肌肉安全性与他汀代谢中的关键酶编码的有机阴离子转运多肽密切相关，有机阴离子转运多肽参与多种药物的转运。在他汀代谢中负责将血液中的药物转移至肝脏直接发挥药效或代谢转化成为有活性的物质。突变的基因会导致转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。而他汀的疗效及预后与载脂蛋白密e切相关，载脂蛋白e通过多种途径参与机体的脂质代谢调节，是影响机体血脂水平的重要内在因素。基于他汀类药物的药物基因组学研究筛选出的两个与药物治疗和副作用反应相关的基因位点，这些基因的多态性与他汀类药物的疗效差异存在一定关联。由于个体的遗传差异、年龄、人种、性别、饮食及生活环境的影响，使得不同个体在降血脂治疗过程中产生不同的疗效。为了避免个体差异造成的治疗结果不佳，可以通过基因检测，利用基因多态性对患者个性化用药，在合适的时间，给患者使用合适的药物，并给予合适的剂量。可以帮助高血脂患者大幅提高治疗效果有效控制血脂，降低并发症发生风险，避免不适用药物带来的不良反应；使得患者在用药时达到安全、经济、有效。技术实现要素：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于指导降血脂用药的snp位点检测试剂盒，包括扩增pcr反应体系，所述扩增pcr反应体系包括pcr预混液和多对pcr引物，所述pcr引物包括：rs429358&rs7412上游引物aatcggaactggaggaacaactrs429358&rs74122下游引物tgctccttcacctcgtccars4149056上游引物aaaggaatctgggtcatacatgrs4149056下游引物agtagacaaagggaaagtgatc；本试剂盒能够对apoe(rs429358，rs7412),slco1b1(rs4149056)的2个基因的3个snp位点进行检测。本发明还提供了一种上述用于指导降血脂用药的snp位点检测试剂盒的使用方法，按照先后顺序包括以下步骤：(1)采用经典的基因组dna提取方法或是基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组dna备用；(2)每管取荧光pcr检测混合液与taq酶，振荡混匀，获得荧光pcr检测混合液与taq酶的共混液；(3)将待测dna样品、ddh2o、多对上游引物rep1、多对下游引物rep2加入装有共混液的pcr管中，盖好管盖，组成pcr反应体系；(4)对步骤(3)的pcr反应体系进行pcr扩增；(5)对多重扩增产物纯化后送一代测序，同时对apoe(rs429358，rs7412),slco1b1(rs4149056)的2个基因的3个snp位点进行检测；(6)根据检测结果指导患者降血脂用药。优选的是，步骤(3)中，所述pcr反应体系的成分组成，包括：共混液10ul，上游引物rep11ul，下游引物rep21ul，基因组dna10-50ng，ddh2o补足20ul。在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，pcr扩增的条件为：s1:95℃预变性15min，s2：95℃变性10s，s3：60℃退火60s，s4：72℃延伸20s，s5：72℃延伸10min，s6：冷却至4℃，其中s2-s4循环35次。在上述任一方案中优选的是，指导使用的糖尿病药为他汀类药物。本发明与现有技术相比：1.本方法采用的是多重pcr扩增的方法同时对3个位点进行检测同时进行扩增，单个反应体系扩增不但简化操作降低失误可能，而且降低实验成本；2.使用一代测序对snp位点进行测序，与二代测序相比测序周期更短，准确性更高；3.对相关基因的3个位点的检测和分析，比市面上同类产品覆盖更广。附图说明图1为一个测序后的结果图；图2为单对引物扩增以及所引物混合扩增的电泳图。具体实施方式为了更进一步了解本发明的
发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。实施例一为了克服现有技术的不足，我们发明了一种可检测降血脂用药疗效和敏感性的方法，该方法检测包含了2个基因的3个位点，分别为apoe(rs429358，rs7412),slco1b1(rs4149056)。本发明提供了一种用于指导降血脂用药的snp位点检测试剂盒，包括扩增pcr反应体系，所述扩增pcr反应体系包括pcr预混液和多对pcr引物，所述pcr引物如表1所示：rs429358&rs7412上游引物aatcggaactggaggaacaactrs429358&rs74122下游引物tgctccttcacctcgtccars4149056上游引物aaaggaatctgggtcatacatgrs4149056下游引物agtagacaaagggaaagtgatc表1：多重扩增引物本发明还提供了一种上述用于指导降血脂用药的snp位点检测试剂盒的使用方法，按照先后顺序包括以下步骤：(1)采用经典的基因组dna提取方法或是基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组dna备用；(2)每管取荧光pcr检测混合液与taq酶，振荡混匀，获得荧光pcr检测混合液与taq酶的共混液；(3)将待测dna样品、ddh2o、多对上游引物rep1、多对下游引物rep2加入装有共混液的pcr管中，盖好管盖，组成pcr反应体系，pcr反应体系的加入量如表2所示；成分组成体积/dna量multiplexpcrmastermix10ul上游引物rep1(10um)1ul下游引物rep2(10um)1ul基因组dna10-50ng水补足20ul表2：扩增pcr反应体系(20ul)(4)对步骤(3)的pcr反应体系进行pcr扩增，pcr扩增条件如表3所示；表3：扩增设定条件(5)对多重扩增产物纯化后送一代测序，同时对apoe(rs429358，rs7412),slco1b1(rs4149056)的2个基因的3个snp位点进行检测，检测结果如图1所示，图1为：rs4149056测序结果显示为纯合子aa；(6)根据检测结果指导患者降血脂用药，具体如表4所示。表4：检测位点与用药指导的关系实施例二单对引物扩增后的产物取10ul进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2，电泳图显示样本扩增条带大小与预期相符，而且条带明亮无非特异性扩增条带，说明引物具有良好的稳定性和特异性。将所有引物合并后进行多重pcr扩增，产物取10ul进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2，产物呈现ladder状，说明pcr扩增时各引物之间不会互相干扰。本领域技术人员不难理解，本发明的用于指导降血脂用药的snp位点检测试剂盒及其使用方法包括上述本发明说明书的
发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12