一种血细胞裂解液及利用该裂解液提取血液中核酸的方法与流程

本发明涉及分子生物学检测领域，特别涉及一种血细胞裂解液及利用该裂解液提取血液中核酸的方法。
背景技术：
：核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。核酸提取是指利用物理、化学方法将核酸从载体中分离出来的过程。目前，在国内大部分医疗机构及科研领域均需要从大批量血液样本中提取核酸。因此，为了保证抽提出高浓度的核酸，人们不断开发出新的技术。核酸提取方法繁多，包括传统的酚-氯仿法、滤膜离心柱法、磁珠吸附法等。这些方法各有其优缺点，但用在全血样本上的核酸提取效果差强人意。传统的方法中，“磁珠法”提取核酸普遍使用的裂解液为含有胍盐的裂解液。胍盐是一种强蛋白质变性剂，采用高浓度的胍盐来裂解细胞，使核酸从蛋白质中释放出来。血液样本传统的核酸提取必须使用蛋白酶k，否则残存的蛋白太多，并且蛋白酶k及其容易残留，这些都会对后续的pcr扩增产生影响。同时，在现有技术的核酸提取操作中，往往采用裂解和提取分步进行的方法步骤，这样就很大程度上增加了样本污染的几率，不利于后续的检测以及检测的准确性。基于这些缺点，市场上急需要一种用途广泛，使用方便，裂解效率更高，不易污染的新型血细胞核酸提取方法。技术实现要素：本发明的一个方面，是针对现有技术中的血细胞核酸提取方法效率低、影响后续试验以及容易污染的缺点，提供了一种血细胞裂解液及利用该裂解液提取血液中核酸的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种血细胞裂解液，所述血细胞裂解液包含质量分数为0.5～1.5％的曲通x-100、终浓度为0.5～1.0m的尿素、质量分数为0.02～0.08％n-月桂酰肌氨酸钠，以及终浓度为0.1～0.3m的氯化钙和/或氯化镁。作为优选，在本发明的实施方式中，上述血细胞裂解液还包含质量分数为3％～10％的肝素磁珠。更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述血细胞裂解液由质量分数为4％～6％的肝素磁珠、质量分数为0.75～1.25％的曲通x-100、终浓度为0.75～1.0m的尿素、质量分数为0.03～0.06％n-月桂酰肌氨酸钠，以及终浓度为0.1～0.2m的氯化钙和/或氯化镁组成。更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述血细胞裂解液由质量分数为5％的肝素磁珠、质量分数为1.0％的曲通x-100、终浓度为0.75m的尿素、质量分数为0.05％n-月桂酰肌氨酸钠，以及终浓度为0.15m的氯化钙和/或氯化镁组成。本发明的另一个方面，是提供了一种血细胞裂解液提取血液中核酸的方法，该方法利用以上任意所述的血细胞裂解液来完成。在上述方法中，所述血细胞裂解液和样本可以在磁珠层析柱管中混匀，也可以在另一个离心管中混匀，然后吸到磁珠层析柱中。但作为优选，所述样本与所述血细胞裂解液直接在层析柱管中混匀。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述方法为将血液样本与所述血细胞裂解液直接在层析柱管中按照9+1的比例混匀，与层析柱共同加热至85℃～95℃，处理5～10分钟，经离心后分离液体，得到的液体中含有所述核酸；其中，所述层析柱为包含由第一层为经熔点为35～50℃的石蜡油处理的吸附膜，中间层为离子交换树脂和肝素磁珠混合物，第二层为滤膜组成的层状结构；作为优选，上述血液样本与所述血细胞裂解液的体积混合比例为9：1。在本发明的技术方案中，发明人创造性地使用曲通x-100、尿素和n-月桂酰肌氨酸钠配合肝素磁珠和氯化钙和/或氯化镁进行血细胞核酸提取。通过肝素磁珠包被的层析柱再次吸附析出核酸中的多余蛋白质等pcr干扰物质。整个裂解时间仅需要10～15分钟。与传统的血液核酸纯化方法相比，操作简单快速，而且大大缩短了操作时间，提取的核酸蛋白质少、核酸得率高。并且，在本发明技术方案中不使用胍盐和蛋白酶k进行核酸提取，不需要洗涤、洗脱等步骤。从而可以有效避免胍盐易受室温、季节温度、盐离子浓度等影响造成的核酸提取效果下降。避免了蛋白酶k的残留对后续pcr扩增产生的影响。本发明的血细胞核酸提取方法，所使用的肝素磁珠有丰富的肝素密度、很高的物理化学稳定性等特点。该磁珠产品表面所偶联的肝素带有大量负电性硫酸根离子基团，在一定ph值下，可以与带正电的蛋白具有强的结合能力。在本发明的裂解液中，从反向原理的角度，加强蛋白和核酸的分离，通过离子与热处理过程使磁珠蛋白凝集，通过高速离心分离核酸，这种方法提取的核酸没有传统核酸提取方法出现蛋白酶k对后续核酸扩增产生的影响。在本发明中，上述肝素磁珠可以为任意合适的市售产品。作为优选，所述肝素磁珠可以为化学修饰的肝素磁珠。作为优选，上述磁珠层析柱套在一个1.5ml或2.0ml的离心管中，样本与血细胞裂解液的混合液与层析柱共同在干热器或水浴锅中进行温度处理。更优选地，为套在1.5ml离心管中进行温度处理。优选处理温度为90～95℃。在本发明中，所述层析柱为至少包含三层复合层的层状结构。其中，第一层为经熔点为35～50℃的石蜡油处理的吸附膜。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述石蜡油的熔点为40℃。上述石蜡油处理吸附膜的方法为在吸附膜上加入50～100微升熔点为35～50℃的石蜡油，要求石蜡油全部覆盖吸附膜为准。所述吸附膜的孔径为1微米，厚度为1毫米。所述吸附膜可以为任意市售吸附膜，例如，上海古朵生物科技有限公司出售的吸附膜。其中，中间层为离子交换树脂和肝素磁珠混合物。所述离子交换树脂可以为任意用于纯化蛋白的离子交换树脂，包括阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述离子交换树脂为chelex100树脂。所述的chelex100树脂为包含配对亚氨基二乙酸离子(在结合多价金属离子过程中用作螯合基团)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述的肝素磁珠为100-1000nm颗粒度。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述chelex100树脂与肝素磁珠填充质量比为1:1-100。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述chelex100树脂与肝素磁珠填充质量比为1:50。其中，第二层膜与第一层的材质可以相同，作为肝素磁珠与chelex100树脂的支撑。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述方法中离心的速度为10000～15000rpm，时间为3～5分钟。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述方法为：将混合有肝素磁珠的裂解液和待检测样品加入到套有1.5ml离心管的磁珠层析柱中，用移液器吹打混匀3～5次，封盖，置85～95℃温处理5～10分钟，10000～15000rpm离心5分钟。析出到1.5ml管里的液体即为提取核酸，对目标核酸进行pcr反应。更具体地，所述核酸提取方法的步骤包括：步骤1)将磁珠层析柱套在无核酸酶的1.5ml离心管中，步骤2)将混合有肝素磁珠的裂解液加入到磁珠包被的层析柱管底部；待检测样品加入到所述混合有肝素磁珠的裂解液中，混匀，85℃～95℃静置5～10分钟；步骤3)将套管移至离心机10000～15000rpm离心5分钟，析出液体即含有要提取的核酸。本发明的另一个方面，是提供了一种血细胞核酸提取试剂盒，其所述试剂盒包含上述血细胞裂解液和/或上述层析柱。除上述血细胞裂解液和/或层析柱以外，试剂盒还可以包含任意根据需求的常规试剂、器械，以及试剂盒说明书。本发明的另一个方面，是提供了一种上述血细胞裂解液的用途，所述血细胞裂解液用于提取全血或培养细胞中的核酸。作为优选，所述血细胞裂解液用于提取全血中的核酸。更优选地，为在pcr检测中提取待测样品的细胞或全血中的核酸。所述核酸包括dna和/或rna。本发明的另一个方面，是提供了一种上述血细胞核酸提取试剂盒的用途，所述试剂盒用于pcr、酶切、分子杂交、文库构建或southern杂交过程中的核酸提取，或用于制备检测ebv的产品。本发明的有益效果为：1)本文发明的磁珠层析柱法通过肝素磁珠吸附蛋白、离心促进核酸和蛋白分离，磁珠层析柱增加提取核酸的纯度，有效去除pcr干扰物质，本发明通过离心管与磁珠层析柱一起进行温度处理，通过离心分离核酸。显示出其方便和高效。与传统的胍盐、蛋白酶k介导的血液核酸分离方法有着极大的优势。2)由于本发明方法，裂解液、样本、磁珠层析柱三位一体，只是通过简单的温度处理，然后离心，通过套管收集核酸，只需要一步即可完成，减少了操作过程中发生污染的可能性，节约了检测时间。3)本发明中核酸提取的裂解液可以充分、有效地裂解细胞，加快裂解进程，复合表面活性剂使核酸与蛋白分离，肝素磁珠吸附蛋白，经温度处理，在钙离子存在的情况下，快速使蛋白变性、凝固，经过离心，肝素磁珠结合的蛋白质快速浓缩，使核酸析出，析出的核酸经过磁珠包被的层析柱，再次除去核酸中残余的蛋白干扰物质。本发明裂解液性质温稳定，不受季节、温度、盐离子浓度等影响，而且操作简单、快速，不易污染，提取核酸得率高，适合临床和科研使用。附图说明图1为本发明实施例1的方法检测ebvdna的结果图；图2为本发明实施例2的方法检测ebvdna的结果图；图3为本发明实施例3的方法检测ebvdna的结果图；图4为使用本发明实施例1中的方法与“全血核酸提取试剂盒”敏感性比较结果图。具体实施方式本发明公开了一种血细胞裂解液及利用该裂解液提取血液中核酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。本发明中使用的术语“肝素磁珠”，是指磁性肝素磁珠(简称肝素磁珠)，现已广泛用于细胞分离、酶的固定、核酸纯化等多个领域。本发明中使用的术语“裂解液”，即“lysisbuffer”，是指为了使样品中的核酸游离在裂解体系中所需加入的一种配制液体。本发明中使用的例如“0.05％n-月桂酰肌氨酸钠”、“1.5％曲通x-100”中的百分比是指物质的纯度。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实验材料与仪器以下实施例中所用的pcr扩增仪器为上海宏石医疗科技有限公司生产的实时荧光定量pcr仪。样本采用临床化验室ebvdna定量检测后的全血。为了详细说明本发明方法的具体实施方式中实施例1和实施例2，分别按照以下浓度配制1l裂解液的工作液以便后续操作使用：方案1)5％肝素磁珠、1.0％的曲通x-100、终浓度0.75m的尿素、0.05％n-月桂酰肌氨酸钠和终浓度0.15m的氯化钙。方案2)10％肝素磁珠、1.5％的曲通x-100、终浓度1.0m的尿素、0.08％n-月桂酰肌氨酸钠和终浓度0.3m的氯化钙。实施例1：ebvdna的实时荧光定量pcr检测分别采用根据上述混合有肝素磁珠的裂解液方案1)配制的试剂对临床诊断明确且经过检测ebvdna定量值为2×102iu/ml患者血液进行如下步骤的操作：步骤1)将磁珠层析柱套在无核酸酶的1.5ml离心管中，步骤2)将混合有肝素磁珠的裂解液20μl加入到磁珠层析柱管底部；取120μl待检测样品加入到所述混合有肝素磁珠的裂解液中，混匀，95℃静置10分钟；步骤3)将套管移至离心机15000rpm离心5分钟，析出液体即为提取核酸。步骤4)将4.0μl(0.5u/μl)单位的taqdna聚合酶与36.0μlpcr反应液(所述反应液为包括浓度40nmol/μl上下游引物和30nmol/μl探针；20nmol/μl的tris碱；20mmol/μl氯化镁；50mmol/μl氯化钾、200umol/μl的dntp和0.001wt％的石绿指示剂的荧光pcr扩增试剂混合液)混匀，取步骤(3)得到的核酸10μl与配制好的pcr反应液40μl混匀，封盖，混匀、瞬时离心，进行pcr扩增。其中正向引物、探针序列引物名称引物序列纯化方式ebv正向引物5’-gggctctggaggcaccta-3’ultrapageebv反向引物5’-ccaccccagtcccgtc-3’ultrapageebv探针5’-fam-tcgaggcaggcttaca-mgb-3’hplc扩增程序：95℃，3分钟；进行45循环的94℃，10秒钟和60℃，30秒钟，在60℃检测荧光信号。实验结果如图1所示，结果表明，按照本实例的试剂配比方案,可以有效准确检测出ebvdna定量值为2×102iu/ml。实施例2：ebvdna的实时荧光定量pcr检测分别采用方案2)配制的试剂对临床诊断明确且经过检测ebvdna定量值为2×102iu/ml乙肝患者血清进行如下步骤的操作：步骤1)将磁珠层析柱套在无核酸酶的1.5ml离心管中，步骤2)将混合有肝素磁珠的裂解液20μl加入到磁珠层析柱管底部；取120μl待检测样品加入到所述混合有肝素磁珠的裂解液中，混匀，85℃静置5分钟；步骤3)将套管移至离心机10000rpm离心10分钟，析出液体即为提取核酸。步骤4)将4.0μl(0.5u/μl)单位的taqdna聚合酶与36.0μlpcr反应液(所述反应液为包括浓度40nmol/μl上下游引物和30nmol/μl探针；20nmol/μl的tris碱；20mmol/μl氯化镁；50mmol/μl氯化钾、200umol/μl的dntp和0.001wt％的石绿指示剂的荧光pcr扩增试剂混合液)混匀，取步骤(3)得到的核酸10μl与配制好的pcr反应液40μl混匀，封盖，混匀、瞬时离心，进行pcr扩增。其中正向引物、探针序列引物名称引物序列纯化方式ebv正向引物5’-gggctctggaggcaccta-3’ultrapageebv反向引物5’-ccaccccagtcccgtc-3’ultrapageebv探针5’-fam-tcgaggcaggcttaca-mgb-3’hplc扩增程序：95℃，3分钟；进行45循环的94℃，10秒钟和60℃，30秒钟，在60℃检测荧光信号。实验结果如图2所示，结果表明，按照本实例的试剂配比方案,可以有效准确检测出ebvdna定量值为2×102iu/ml的患者血液标本。实施例3：ebvdna的实时荧光定量pcr检测分别采用根据上述混合有肝素磁珠的裂解液方案1)配制的试剂对临床诊断明确且经过检测ebvdna定量值为2×102iu/ml患者血液进行如下步骤的操作：步骤1)将磁珠层析柱套在无核酸酶的1.5ml离心管中，步骤2)将混合有肝素磁珠的裂解液20μl加入到磁珠层析柱管底部；取120μl待检测样品加入到所述混合有肝素磁珠的裂解液中，混匀，90℃℃静置8分钟；步骤3)将套管移至离心机12000rpm离心5分钟，析出液体即为提取核酸。步骤4)将4.0μl(0.5u/μl)单位的taqdna聚合酶与36.0μlpcr反应液(所述反应液为包括浓度40nmol/μl上下游引物和30nmol/μl探针；20nmol/μl的tris碱；20mmol/μl氯化镁；50mmol/μl氯化钾、200umol/μl的dntp和0.001wt％的石绿指示剂的荧光pcr扩增试剂混合液)混匀，取步骤(3)得到的核酸10μl与配制好的pcr反应液40μl混匀，封盖，混匀、瞬时离心，进行pcr扩增。其中正向引物、探针序列引物名称引物序列纯化方式ebv正向引物5’-gggctctggaggcaccta-3’ultrapageebv反向引物5’-ccaccccagtcccgtc-3’ultrapageebv探针5’-fam-tcgaggcaggcttaca-mgb-3’hplc扩增程序：95℃，3分钟；进行45循环的94℃，10秒钟和60℃，30秒钟，在60℃检测荧光信号。实验结果如图3所示，结果表明，按照本实例的试剂配比方案,可以有效准确检测出ebvdna定量值为2×102iu/ml的患者血液标本。如图3所示，使用本实施例的裂解液对2×102iu/ml的ebv感染者血液进行检测时，不仅可以有效对其定量，并且其pcr的效率高于实施例1和实施例2的pcr效率。实施例4：使用本发明方法与“全血核酸提取试剂盒”敏感性比较验证本发明方法与“全血核酸提取试剂盒”性能差异。分别使用本发明实施例3的裂解液和“全血核酸提取试剂盒”(天根生化科技(北京)有限公司)，利用与实施例3相同的方法对临床诊断明确且经过检测ebvdna定量值为2×106iu/ml和5×103iu/ml的患者全血进行实时荧光定量pcr检测。结果如图4所示，实验结果表明，使用本发明的裂解液提取ebvdna的扩增曲线梯度明显优于“全血核酸提取试剂盒”敏感性。扩增曲线的ct值提前至少1个ct值。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12