EPSPSII微流控芯片检测的引物、方法和试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于农产品中转基因成分epspsii检测的寡核苷酸引物，用于测定农产品中转基因成分epspsii的环介导等温扩增检测方法，用于快速检测农产品中转基因成分epspsii的环介导等温扩增微流控芯片检测试剂盒以及农产品中转基因成分epspsii的特异性寡核苷酸引物在检测农产品中转基因成分时的应用。

背景技术：

转基因作物：

现代生物技术以其方便、快速、准确等特点，从基因水平分析原料和产品的来源与特性，特异性强、灵敏度高，在农产品转基因检测中得到了广泛应用。但是，环介导等温扩增微流控芯片检测技术在农产品转基因检测中的应用较少。

目前，国内外尚未见报道能够快速、简便、特异且灵敏地检测大豆、玉米、大米、棉花、油菜及其加工品中转基因成分的环介导等温扩增微流控芯片检测方法和试剂盒。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高，微量体系，多个指标通量的农产品中转基因成分的检测方法，进行大豆、玉米、大米、棉花、油菜种子及其加工品中转基因成分的检测。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于，提供准确检测农产品中转基因成分epspsii的特异性寡核苷酸引物。

本发明的另一个目的在于，提供准确测定农产品中转基因成分epspsii的环介导等温扩增微流控芯片检测方法。

本发明的另一个目的在于，提供准确测定农产品中转基因成分epspsii的环介导等温扩增微流控芯片检测试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供农产品中转基因成分epspsii的特异性寡核苷酸引物在准确检测农产品中转基因成分中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的发明人根据基因epspsii设计了能特异性鉴别农产品中转基因元件epspsii的寡核苷酸引物组，能从样品dna中高效特异扩增出一段较短的epspsii特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组，所述引物组是根据epspsii基因序列在类似序列中具有差异性的特点而设计的。所述引物组由外引物、内引物、环引物组成，所述外引物1为ctatgcaagctatgggtgccaga（seqidno.1），所述外引物2为cgacccattggacgcttagtga（seqidno.2）；所述内引物1为cgagaggagcctcaggagcaaggtccgtaaggaaggtgatacttgga（seqidno.3），所述内引物2为gtaacgctgcaactggttgccgtgcgtcaccaatgaaagtgctatcg（seqidno.4）；所述环引物1为agtccaccgttaccaacatcatca（seqidno.5），所述环引物2为tgggtcttgttggtgtttacga（seqidno.6）。在一个实施方案中，本发明提供的epspsii特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物组。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于环介导等温扩增方法定性检测农产品中转基因成分的组合物，所述组合物包含epspsii特异性寡核苷酸引物组，其中所述epspsii特异性引物组由外引物、内引物、环引物组成，所述外引物的碱基序列为seqidno.1、seqidno.2，所述内引物的碱基序列为seqidno.3、seqidno.4，所述环引物的碱基序列为seqidno.5、seqidno.6。所述的环介导等温扩增条件为65℃，60min。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于准确定性检测农产品中转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于环介导等温扩增方法检测农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组以及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒优选实施方案中，本发明的农产品中转基因成分定性检测特异性寡核苷酸引物组是根据epspsii基因序列在类似序列中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的epspsii特异性寡核苷酸引物组由外引物、内引物、环引物组成，所述外引物的碱基序列为seqidno.1、seqidno.2，所述内引物的碱基序列为seqidno.3、seqidno.4，所述环引物的碱基序列为seqidno.5、seqidno.6。

在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测农产品中转基因成分的环介导等温扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的pcr扩增条件是65℃，60min。在一个具体的实施方案中，本发明用于农产品中转基因成分定性检测的试剂盒还包括对照品。对照品包括阴性对照品和阳性对照品。在一个实施方案中，阳性对照为含有靶基因序列的质粒dna。

本发明以epspsiidna为检测基础，根据epspsii基因序列在类似序列中具有差异性的特点，比对分析了epspsii基因序列。根据这些序列设计引物，利用环介导等温扩增法定性检测样品中的农产品中转基因成分。

本发明的环介导等温扩增检测方法采用完全闭管检测，无需扩增产物后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了环介导等温扩增技术的dna高效扩增、特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。本发明的按照引物序列制成的试剂盒，用于此类产品的定性检测，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。使用本发明的环介导等温扩增检测方法和微流控芯片检测试剂盒，可用于定性检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上大豆、玉米、大米、棉花、油菜及其加工品等样品中农产品中转基因成分的检测等。

附图说明

图1管式扩增中引物特异性检测结果图中显示环介导等温扩增特异性检测epspsii的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物组seqidno.1-6检测，其中基线上方为阳性样品的扩增曲线，基线下方为大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯、番茄、黑豆、蚕豆、油菜、白菜、绿豆、芝麻、芋头、黄瓜、香菇、红薯（市场随机购买制备）等样品及空白对照（无菌双蒸水）。

图2管式扩增中引物灵敏度检测结果图中显示是对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的绝对灵敏度进行评价，将转基因dna浓度依次梯度稀释，反应终浓度依次为5ng/μl、4ng/μl、3ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl以及空白对照（无菌双蒸水）。

图3管式扩增中引物检出限检测结果图中显示是对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的相对灵敏度进行评价，使用购买标准品或将阳性样品和阴性对照混合，使转基因成分含量的质量比分别为100%、50%、10%、5%、1%、0.5%及0.1%。

图4芯片扩增引物包埋浓度比例针对引物扩增体系灵敏度的特点，结合所使用的酶等反应试剂对引物的要求以及芯片本身的生物特性，采用两种浓度比例进行实验，引物包埋比例如表1所示。芯片中两组重复在对应反应池均出现“s”形扩增曲线，并且出峰时间，峰形等均一致，则说明所包埋引物浓度比例适合epspsii引物的筛选优化（a图为碟片i，b图为碟片ii）。

表1.引物包埋比例

图5芯片扩增中引物特异性结果a图显示的是环介导等温扩增特异性检测epspsii的在碟片反应中的结果，其中所使用特异性寡核苷酸引物组seqidno.1-6先包埋固定于碟片反应池中，然后配置体系进行检测。其中epspsii基因以及阳性对照分别对应反应池出现“s”形扩增曲线，底部归一基线为其他反应池对应等样品及空白对照（无菌双蒸水）；b图显示的是dna模板为非转基因大豆、玉米、水稻及小麦在碟片反应中的结果，其中epspsii对应反应池出现“s”形扩增曲线,底部归一基线为其他反应池对应等样品及空白对照（无菌双蒸水）。

图6芯片扩增中引物灵敏度结果图中显示是对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的绝对灵敏度进行评价，将转基因dna浓度依次梯度稀释，每个反应池达到100ng／μl，75ng／μl、50ng/μl、25ng/μl（分别对应图中编号a-d）。

图7芯片扩增中引物检出限检测结果图中显示对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的相对灵敏度进行评价，使用购买标准品或将阳性样品和阴性对照混合，使转基因成分含量的质量比分别为0.1%、1%、5%（分别对应图中编号a-c）。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例为通过如下试验对epspsii特异性检测引物组进行管式扩增反应中及碟片扩增反应中引物反应的特异性和灵敏度评价。具体为通过扩增反应检测epspsii基因序列，可以确定epspsii特异性检测引物组的特异性和检测灵敏度。

所使用的epspsii灵敏度及特异性检测的引物序列为：引物序列seqidno.1～6

管式扩增反应中反应体系为：rmbuffer(荣研试剂)4.2μl；epspsii引物mix(外引物：内引物：环引物＝0.5μm：1μm：4μm)3μl；bstdnapolymerase0.4μl,染料evagreen（20＊）0.4μl，模板dna2μl；加ddh2o至总体积为10μl。反应程序为65℃60min。针对特异性和灵敏度检测使用不同的模板dna。

碟片扩增反应中反应体系为：每份扩增反应体系总体积配制为52μl。其中bstdna聚合酶3μl（8u/μl），反应缓冲液rm(荣研试剂)26μl，模板量（对照品按照说明书操作）（>2400ng）（针对特异性和灵敏度检测使用不同的模板dna），引物按照一定浓度比例包埋于芯片反应池内，其他使用蒸馏水补齐至体系达到52μl体系。震荡几秒充分混合均匀，瞬时离心至管底。

所使用的检测主要仪器：微量移液器(10µl、100µl、1000µl，eppendorf)、实时定量pcr仪器（abi7500），博奥等温扩增微流控芯片核酸分析仪，微型高速离心机，低速离心机，生物安全柜等。

检测主要试剂及耗材：荣研试剂，染料、碟式芯片及封口膜分别购于北京博奥晶典生物技术有限公司；qiagen基因组抽提试剂盒，tiangen植物基因组抽提试剂盒，mn（nucleospin®food）试剂盒抽提；引物由上海生工生物科技有限公司合成等。

检测主要步骤：

1dna提取

检测样本：制备样品用于特异性及灵敏度分析；（a）将提取的植物基因组dna（为100％转基因成分含量）溶液用无菌水分别稀释至加样反应的终浓度为5ng/μl、4ng/μl、3ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl及0.01ng/μl的浓度，用于初步分析引物组合的绝对灵敏度；后期需要对含有靶基因序列的质粒dna进行梯度稀释，用于进一步分析epspsii基因引物组合的绝对灵敏度；（b）使用标准品以确定epspsii基因特异性引物组合的相对灵敏度；将转化了空载体的植物材料和对应转基因含量100%的植物材料混合，使转基因成分质量比分别为0.1%、0.5%、1%、5%、10%、50%及100%、以确定epspsii基因特异性引物组合的相对灵敏度。

样本核酸制备：使用三种不同的方法抽提的核酸均可满足检测需求(附表2)，（样本核酸制备：使用三种不同的方法抽提的核酸均可满足检测需求，本专利中所用核酸均采用nucleospin®food试剂盒进行抽提。

表2.三种试剂盒dna提取对比

2环介导等温扩增检测所用引物

引物序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4，seqidno.5和seqidno.6

3管式扩增反应步骤

环介导等温管式扩增反应体系：

rmbuffer4.2μl

bstdna聚合酶：0.4μl

dye：0.4μl

外引物(10μm)0.5μl+0.5μl

内引物(80μm)0.5μl＋0.5μl

环引物(20μm)0.5μl＋0.5μl

模板dna2μl

加ddh2o至总体积为10μl

注：每次检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替dna模板，检测试剂是否受到污染)；

环介导等温管式扩增反应参数：65℃60min

注：不同仪器应将试剂及反应参数做适当调整。

4.碟片扩增反应中反应步骤

表3反应体系组成

体系配置：针对特异性和灵敏度检测使用不同的模板dna。

上样：用移液器吸取51μl上述配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口1加入到芯片主通道中（至少充满2-23孔），待其充满芯片主通道即停止加样。取1张封口膜，覆盖于进出样口上，再取一支洁净吸头，向一个方向按压封口膜至贴合紧密。

核酸扩增及结果判读:

①打开rtisochip™-a等温扩增微流控芯片核酸分析仪和相应软件，点击“打开光源”按钮，预热10分钟。

②点击“出仓”按钮，将芯片盖片向上平稳放置在托盘上，托盘中心定位装置与芯片中心大圆孔对齐，托盘定位小圆柱从芯片中心缺口处穿出以固定芯片。点击“入仓”按钮，将芯片送入核酸分析仪中。

③在检测界面的“样本信息”区域录入待检样本的信息，其中样本编号、芯片编号和样品类型为必填项，其它为选填项。样本信息录入后，可点击操作区域的“开始检测”按钮开始样本检测

如图1所示，环介导等温扩增特异性检测epspsii的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物组seqidno.1-6检测，其中基线上方为阳性样品的扩增曲线，基线下方为马铃薯、玉米、小麦、大米、大豆、番茄、黑豆、蚕豆、油菜、白菜、绿豆、芝麻、芋头、黄瓜、香菇、红薯（市场随机购买制备）等样品及空白对照（无菌双蒸水），充分说明本实验设计的引物对目标样品特异。

为确定特异性引物探针组合的绝对检测限，将提取的dna溶液用无菌水分别稀释为5ng/μl、4ng/μl、3ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl及0.01ng/μl的浓度，分别按上述条件进行环介导等温扩增扩增，结果如图2所示。dna终浓度为5ng/μl、4ng/μl、3ng/μl、2ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl及0.1ng/μl时有特异性扩增曲线，而终浓度降至0.1ng/μl以下时，没有特异性扩增曲线。目前实验结果表明建立的环介导等温扩增检测方法能够检出epspsii成分的含量为0.1ng/μl。

对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的相对灵敏度进行评价如图3所示，使用购买标准品或将阳性样品和阴性对照混合，使转基因成分含量的质量比分别为0.01%、0.1%、1%、5%、10%、50%及100%，核酸抽提后进行检测。其中基线上方为阳性样品的扩增曲线，基线下方为灵敏度未达到的含量限度、阴性及空白对照。实验结果说明该方法检测epspsii成分的相对灵敏度为0.1%。

芯片扩增引物包埋浓度比例如图4显示，针对引物扩增体系灵敏度的特点，结合所使用的酶等反应试剂对引物的要求以及芯片本身的生物特性，采用两种浓度比例进行实验。当引物浓度比例为：芯片中两组重复在对应反应池均出现“s”形扩增曲线，并且出峰时间，峰形等均一致，则说明所包埋引物浓度比例适合epspsii引物的筛选优化。

针对芯片扩增反应中引物特异性检测结果如图5中显示：除mon89788样品出现典型的s型扩增曲线外，其它样品：马铃薯、玉米、小麦、大米、大豆、番茄(市场随机购买制备)等均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的引物在芯片反应中只对目标样品特异。

芯片扩增中引物灵敏度结果如图6中显示。对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的绝对灵敏度进行评价，将转基因dna浓度依次梯度稀释，加样至每个反应池达到100ng／反应池，75ng／反应池、50ng/反应池、25ng/反应池。结果显示当mon89788样品的浓度达25ng／反应池时，引物的两个重复均出现典型的s型扩增曲线。

芯片扩增中引物检出限检测结果如图7中显示。对环介导等温扩增特异性检测转基因成分的相对灵敏度进行评价，使用购买标准品或将阳性样品和阴性对照混合，使转基因成分含量的质量比分别为0.1%、1%、5%。结果显示当mon89788样品的转基因成分含量比达到1％时，引物的两个重复均出现典型的s型扩增曲线。

实施例2

本实施例提供准确检测农产品中转基因成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明用于环介导等温扩增方法鉴别农产品中转基因成分的特异性寡核苷酸引物组以及使用说明书。所述试剂盒包括引物组seqidno.1～6，微流控芯片、dna纯化试剂盒、阳性质控质粒dna、阴性质控（意义不大），所述使用说明书中的扩增条件条件博奥等温扩增微流控芯片核酸分析仪自带软件的参数。对于不同需求，反应参数可做适当调整。

如图7所示，利用环介导等温扩增检测epspsii基因序列时，epspsii阳性样品碟片阳性对照pc出现典型的s型扩增曲线，其它反应池荧光曲线均在基线位置，表明该方法能有效检测出农产品中转基因成分。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。