一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株及其应用。

背景技术：

竹黄，又名竹花、竹赤团子、竹三七等，具有止咳祛痰、散瘀通经、活血止痛、恢复组织机能、增强体质、补中益气和镇静的作用，是我国一种稀有的真菌中药材。竹黄是竹黄菌(shiraiabambusicola)的子座。竹黄菌隶属于肉座菌科的竹黄属，特异性地寄生在短穗竹属种类的嫩枝上，其子座常见于衰败的竹林中。

竹黄子座中核心药用成分是一系列具有光敏活性的苝醌色素，主要包括竹红菌甲素(hypocrellina)、竹红菌乙素(hypocrellinb)、竹红菌丙素(hypocrellinc)、竹红菌丁素(hypocrellind)四种。其中，竹红菌甲素含量最高。竹红菌甲素和乙素在一定的条件下可以互相转化，与丙素互为同分异构体。竹红菌甲素具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗炎、利尿保肝、抗癌等活性。研究表明，竹红菌甲素可用来杀伤人源的hela细胞、黑色素瘤b-16细胞及hce-8693盲肠癌细胞以及抑制hiv病毒。临床上，以竹红菌甲素为主要原料的药膏，已经用于治疗妇科外阴白色病变和瘢痕疙瘩等疾病。竹红菌甲素还可以作为食品的防腐剂以及保护剂。天然竹红菌甲素主要提取自竹黄菌和竹红菌(hypocrellabambusae)的子座，但是其产量稀少且不稳定，季节性强，无法满足医药、食品等市场对色素日益增长的需求。竹红菌色素的生产方法还有人工化学合成法。化学从头合成一般要经历20几步反应，合成和分离的成本过高。发酵法具有绿色、产物分离简单和不受季节影响等的优点，是生产竹红菌色素最有前景的方法之一。

菌种和发酵工艺控制是发酵生产竹红菌色素的核心技术。目前发酵法使用的菌种为分离自竹黄菌子座的菌丝体。发酵竹黄菌株产竹红菌色素的代表性技术有如表1所示：

表1发酵竹黄菌株产竹红菌色素的代表方法

[1]章明晔.光质对竹黄菌生长及竹红菌素生产的调控研究[d].苏州大学,2016.

[2]胡明明.苝醌类色素液态发酵及其分离纯化的研究

[3]梁晓辉.竹黄菌发酵产竹红菌素的研究[d].江南大学,2009.

根据现有报道分析可知，竹黄菌丝体的生理性状、分泌色素的能力受到子座的产地、分离的子座部位和子座成熟度的影响。竹黄菌株之间的菌丝体形态、生长速度、产色素的性能具有明显的差异。同时竹黄菌丝体多次转代易出现生长和色素分泌退化的现象。因此，提供生长迅速、高产色素和性能稳定的菌丝体并实现其在液体发酵中的应用，对生产竹红菌甲素具有重要的意义。

生物燃料是全球绿色燃料使用的趋势。随着生物柴油的产量逐年增加，每年将产生大量的甘油副产物，这些甘油存在二次污染和综合利用的难题。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株。

本发明的另一目的在于提供上述高产竹红菌甲素的竹黄菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株高产竹红菌甲素的竹黄菌株mh-02，为竹黄无性型菌株，其分类命名为shiraiabambusicola.保藏编号为gdmccno.60438，于2018年8月22日保藏于位于中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的竹黄菌株的主要代谢产物为竹红菌甲素。

上述的高产竹红菌甲素的竹黄菌株在生产竹红菌甲素中的应用。

一种制备竹红菌甲素的方法，包括如下步骤：

(1)取所述的高产竹红菌甲素的竹黄菌株，培养活化，制备种子液；

(2)将所述的种子液接入发酵培养基进行发酵，获得菌丝体；对菌丝体处理；

(3)从处理后的菌丝体中分离出竹红菌甲素。

步骤(1)中所述的培养活化过程的温度优选为15℃～30℃。

步骤(2)中所述的制备种子液，是将培养活化后的菌株接入种子培养基中，振荡培养制得种子液。

所述的种子培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)。

所述的振荡培养的条件优选为于130-170rpm的条件震荡培养45-50h。

步骤(2)中所述的发酵优选为液体深层发酵；更优选为液体深层通风发酵。液体深层培养条件下所述的竹黄菌株的主要色素产物为竹红菌甲素。

步骤(2)中所述的发酵的条件优选为130-170rpm的条件震荡培养65-75h。

步骤(2)中所述的发酵的温度优选为26℃～30℃。

步骤(2)中所述的发酵培养基的ph优选为4.0～9.0。

步骤(2)中所述的发酵培养基中的碳源为葡萄糖、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、蔗糖或同类碳源中的至少一种，优选甘油。

步骤(2)中所述的发酵培养基中的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢铵或同类氮源中的至少一种。

步骤(2)中所述的处理的具体步骤如下将菌丝体和抽提液混合，超声处理获得发酵产物。

所述的抽提液优选为二氯甲烷。

所述的超声处理的条件优选为于280-320w处理28-32min。

步骤(3)中所述的竹红菌甲素的分离方法优选为hplc。

所述的hplc的色谱柱优选为intersilods3c18柱。

所述的hplc的柱温优选为25-35℃。

所述的hplc的检测波长467nm。

所述的hplc的进样量为10μl。

所述的hplc的流动相为纯甲醇；流速为1ml/min。

所述的hplc的时间为25min。

本发明相对于现有技术具有但是并不限于如下的优点和技术效果：

天然的竹黄子实体中粗色素的含量为10-15mg/g菌丝体，甲素占总色素含量为65％-80％。使用本发明提供的竹黄菌株生产竹红菌甲素的产率最高可达到20mg/g菌丝体，竹红菌甲素在总色素中的含量为95％以上，明显优于现有技术的竹黄菌株，能够显著降低后续分离纯化的成本。本发明提供的竹黄菌株能够专一性偏好甘油作为高产甲素碳源，而现有的竹黄菌株难以利用甘油作为碳源，或者利用甘油时的转化率较低；本发明利用甘油作为唯一碳源时，竹红菌甲素产率为19.5±2.8mg/g菌丝体，生物转化率为6.0±0.85mg/g碳源，分别是可溶性淀粉、木糖醇、半乳糖、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖的31.4、4.1、3.6、3.1、3.0、2.3、2.2、1.8、1.8倍。使用该菌株转化甘油为高附加值的竹红菌甲素，转化率高，为甘油的综合利用提供了一条环保和高效的途径。

附图说明

图1：菌株在pda平板上生长120h时的菌落形态图；

图2：菌株5.8srdna和内转录间隔区(its)的pcr扩增产物的电泳图，其中，m为dnamarker；

图3：竹红菌甲素标准品的hplc图；

图4：实施例2发酵结束后菌丝体色素提取物的hplc图；

图5：实施例3发酵结束后菌丝体色素提取物的hplc图；

图6：实施例4发酵结束后菌丝体色素提取物的hplc图；

图7：实施例5发酵结束后菌丝体色素提取物的hplc图；

图8：实施例6发酵结束后菌丝体色素提取物的hplc图。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明。

实施例1

从产自中国浙江的竹黄子实体上分离得到的野生型菌株。

将所述的竹黄菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)培养。

菌丝形态：菌丝培养初期，菌落为白色，较稀疏，质地疏松，呈绒状；培养6天后，色素开始分泌到胞外，平板背面开始呈现黄褐色；随着培养时间的延长，与培养基相接触菌丝体分泌色素呈现出同心褐色圆圈分布。其菌丝形态特征为：气生菌丝直径23-50μm，具有锁状联合，无分生孢子产生。其中，菌株在pda平板上生长120h时的外观菌落形态如图1所示。

菌株生理生化特征：可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、甘露醇、半乳糖、可溶性淀粉、纤维素等碳源。菌丝生长状况分别为：旺盛、较稀疏、旺盛、较稀疏、较稀疏、较稀疏、旺盛、较稀疏。对光照敏感，生长受抑制。可生长的ph范围4-9。

对该菌株的基因组dna进行提取，以提取的dna为模板，使用its5和its4引物对5.8srdna和内转录间隔区(its)进行pcr扩增和测序，其扩增产物的电泳结果如图2所示；其5.8srdna和内转录间隔区的序列如下所示：

tgattcctcccgggttttgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaaacgtggtaaaaagcttatctggacgccagtattccggcttggactcgcaaattgtgctgcgctccaaggccaaaatgccggctgccaatatctttaaggcgagtccagtcgcagaggataggacaaacacccaacaccaagcagagcttgagggtacaaatgacgctcgaacaggcatgccccatggaataccaaggggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacactacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttgtaaatattttttttttcagacgctgattgcaattacaatgagtttaagagatcctatcgactggaaacccagccgaggaaacatgtagtacgcaaaaaacatgggtgcagacgggggctatattgctataaccccgtactactaggtaatgatccttccgcaggttcacctacggaaaccttgttacgatt。

其引物的序列如下所示:

its4：tcctccgcttattgatatgc

its5：ggaagtaaaagtcgtaacaagg

上述的序列与shiraiasp.bfm-l31菌株的its序列(检索号ab369481)相似度极高，差异仅为0.2％，与文献中已报道高产色素的shiraiasp.super-h168菌株的its序列(检索号eu267793.1)差异为2％。

将该菌株命名为shiraiabambusicolamh-02，于2018年8月22日在广东省微生物菌种保藏中心进行保藏，其保藏编号为gdmccno.60438。

实施例2

取pda平板上培养5天的菌株，打孔接入含有50mlpdb培养基(马铃薯葡萄糖培养基)的三角瓶中，置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h，制备种子液。

取2ml种子液接入含有50ml发酵培养基(含有麦芽糖0.9g，牛肉膏0.05g，mgcl20.001g)的三角瓶中，置于摇床中，在温度28℃，转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。

摇瓶培养结束，将菌丝体用超纯水离心洗涤后，真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30ml的比例加入二氯甲烷，30℃下超声提取30min，超声功率为300w。提取物利用hplc进行分离和鉴定。色谱条件：色谱柱：intersilods3c18柱，柱温：30℃，检测波长：467nm，进样量：10μl，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，时间为25min，结果如图4所示。

以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考，竹红菌甲素产率为7.49mg/g菌丝体，纯度为92.2％，转化率为2.32mg/g碳源。

实施例3

取pda平板上培养3天的菌株，打孔接入含有50ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基pdb培养基的三角瓶中，置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h，制备种子液。

取2ml种子液接入含有50ml发酵培养基(含有葡萄糖1.0克，蛋白胨0.5克，mgcl20.001g)的三角瓶中，置于摇床中，在温度28℃，转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。

摇瓶培养结束，将菌丝体用超纯水离心洗涤后，真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30ml的比例加入二氯甲烷，30℃下超声提取30min，超声功率为300w。提取物利用hplc进行分离和鉴定。色谱条件：色谱柱：intersilods3c18柱，柱温：30℃，检测波长：467nm，进样量：10μl，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，时间为25min，结果如图5所示。

以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考，竹红菌甲素产率为14.39mg/g菌丝体，纯度为88.3％，甲素转化率为4.71mg/g碳源。

实施例4

取pda平板上培养5天的菌株，打孔接入含有50mlpdb培养基的三角瓶中，置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h，制备种子液。

取2ml种子液接入含有50ml发酵培养基(含有蔗糖0.8g，玉米粉0.3g)的三角瓶中，置于摇床中，在温度28℃，转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。

摇瓶培养结束，将菌丝体用超纯水离心洗涤后，真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30ml的比例加入二氯甲烷，30℃下超声提取30min，超声功率为300w。提取物利用hplc进行分离和鉴定。色谱条件：色谱柱：intersilods3c18柱，柱温：30℃，检测波长：467nm，进样量：10μl，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，时间为25min，结果如图6所示。

以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考，竹红菌甲素产率为5.57mg/g菌丝体，纯度为86.9％，转化率为1.27mg/g碳源。

实施例5

取pda平板上培养3天的菌株，打孔接入含有50mlpdb培养基的三角瓶中，置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h，制备种子液。

取2ml种子液接入含有50ml发酵培养基(含有甘油0.8g，酵母粉0.3g，mgcl20.001g)的三角瓶中，置于摇床中，在温度28℃，转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。

摇瓶培养结束，将菌丝体用超纯水离心洗涤后，真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30ml的比例加入二氯甲烷，30℃下超声提取30min，超声功率为300w。提取物利用hplc进行分离和鉴定。色谱条件：色谱柱：intersilods3c18柱，柱温：30℃，检测波长：467nm，进样量：10μl，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，时间为25min，结果如图7所示。

以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考，竹红菌甲素产率为19.52mg/g菌丝体，纯度为90.2％，转化率为6.63mg/g碳源。

实施例6

取pda平板上培养5天的菌株，打孔接入含有50mlpdb培养基的三角瓶中，置于摇床中控制150rpm、28℃下培养48h，制备种子液。

取2ml种子液接入含有50ml发酵培养基(含有麦芽糖1.2g，磷酸二氢铵0.3g，mgcl20.001g)的三角瓶中，置于摇床中，在温度28℃，转速150rpm条件下进行色素发酵培养72h。

摇瓶培养结束，将菌丝体用超纯水离心洗涤后，真空冷冻干燥12h。按照1g菌丝体加入30ml的比例加入二氯甲烷，30℃下超声提取30min，超声功率为300w。提取物利用hplc进行分离和鉴定。色谱条件：色谱柱：intersilods3c18柱，柱温：30℃，检测波长：467nm，进样量：10μl，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，时间为25min，结果如图8所示。

以竹红菌甲素的标准品(图3)进行参考，竹红菌甲素产率为10.38mg/g菌丝体，纯度为85.8％，转化率为3.36mg/g碳源。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。