一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法与流程

文档序号:22739077发布日期:2020-10-31 09:20阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统,是一种双质粒的crispr-cas辅助的nhej编辑系统,包括crispr系统表达质粒和nhej元件表达质粒,其特征在于,所述crispr系统表达质粒包含sgrna作用元件和cas基因,所述nhej元件表达质粒包含nhej元件基因以及降低reca依赖的同源重组的基因元件recx或recamtbr61c。

2.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述crispr系统表达质粒是穿梭载体或整合载体,其上的cas基因和sgrna作用元件均由诱导型启动子驱动表达。

3.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述cas基因是cas9基因,优选为来源于嗜热链球菌的cas9sth1基因。

4.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述crispr系统表达质粒上的cas基因的终止密码子前加入了ssra降解标签,其序列为5’-gccgccgactcgcaccagcgcgactacgccctggccgcc-3’。

5.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述crispr系统表达质粒上的sgrna作用元件的序列如序列表中seqidno:19所示。

6.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述crispr系统表达质粒含有成对的sgrna作用元件。

7.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述nhej元件表达质粒含有来自于海分枝杆菌的nhej元件,包括kuc、nrga和ligd三个基因;同时含有降低reca依赖的同源重组的基因元件recx或recamtbr61。

8.如权利要求1所述的基因编辑系统,其特征在于,所述nhej元件表达质粒还包含复制起点orie、不稳定复制子pmf1和sacb反向筛选标记。

9.一种对结核分枝杆菌进行基因编辑的方法,利用权利要求1~8任一所述的基因编辑系统进行如下步骤:

1)将针对目标基因片段的sgrna靶标序列连接到所述crispr系统表达质粒上的sgrna作用元件中,得到含有靶标序列sgrna的crispr系统表达质粒;

2)用所述nhej元件表达质粒转化结核分枝杆菌,并将转化子制备成感受态细胞;

3)用步骤1)制备的含有靶标序列sgrna的crispr系统表达质粒转化步骤2)制备的感受态细胞,对得到的转化子进行验证,得到目标基因片段被编辑的结核分枝杆菌。

10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,步骤3)向高表达nhej元件和recx或recamu的结核分枝杆菌感受态细胞电击转化含有靶标序列sgrna的crispr系统表达质粒。

11.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述crispr系统表达质粒为穿梭载体,在步骤1)中将针对目标基因片段的一个靶标序列连接到该质粒中,再经过步骤2)和3)获得目标基因片段被编辑的结核分枝杆菌;或者,在步骤1)中将两个不同的靶标序列连接到成对的sgrna作用元件中,得到含有两个靶标序列sgrna的crispr系统表达质粒,再经过步骤2)和3)获得大片段删除的结核分枝杆菌或者双重突变的结核分枝杆菌。

12.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述crispr系统表达质粒为整合载体,在步骤1)构建含有不同靶标序列sgrna的多个crispr系统表达质粒,在步骤3)将这些将crispr系统表达质粒混合转化含有所述nhej元件表达质粒的结核分枝杆菌感受态细胞,构建结核分枝杆菌突变库。


技术总结
本发明公布了一种应用于结核分枝杆菌的基因编辑系统及方法,利用CRISPR技术与NHEJ修复系统偶联,实现了对结核分枝杆菌基因的高效、快速的遗传操作。本发明的基因编辑系统通过高表达NHEJ元件和抑制RecA介导的同源重组来提升NHEJ修复效率,并使DNA双链断裂发生在菌体生长的稳定期,能够实现精确删除以及同时引入多重突变,并可用于构建突变库,为研究结核分枝杆菌提供了有效的技术手段。

技术研发人员:孙义成;闫玫漪;李斯尚;丁鑫园;郭晓鹏;金奇
受保护的技术使用者:中国医学科学院病原生物学研究所
技术研发日:2019.04.26
技术公布日:2020.10.30
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