一种四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇及制备与应用的制作方法

本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇及制备与应用。

背景技术：

微生物病原体，可引起动物、植物和人类的感染和疾病，长期以来一直是对人类健康和社会发展的威胁。每年由细菌、病毒和真菌感染引起的人口死亡人数占全球死亡人数的四分之一。由于微生物到处存在并且可以通过空气、水和食物等传播，控制和预防微生物感染是一个很大的挑战。为了对抗微生物病原体，各种抗菌剂，包括抗生素、消毒剂和防腐剂已经广泛使用。然而，抗生素和消毒剂的普及和不正当使用已经诱导出抗菌性微生物的新菌株，导致抗菌问题的急剧增加。因此，迫切需要开发低毒、高效、不易产生耐药性的新型抗菌剂。

常规抗微生物剂，是基于天然或低分子量化合物制备的。由于低分子量抗菌剂容易扩散对人体造成毒性，同时长期使用容易产生耐药性及其导致环境污染等问题，而限制了其进一步使用。高分子量的抗菌聚合物避免低分子量抗菌剂从聚合物基质中渗透的问题，以环保的方式保证其抗菌的耐久性。聚乙烯醇(pva)含有众多羟基且具有较好的水溶性。pva具有良好的生物相容性和生物降解性，同时其纺丝、成膜和成凝胶性能优异，到目前在伤口缝线、人造皮肤、骨骼修复材料、药物输送载体、隐形眼镜和食品包装材料等领域用途广泛。因此将传统的小分子抗菌剂与pva相结合，开发pva基的抗菌剂具有诱人的前景。

自2001年以来，具有聚集诱导发光(aggregation-inducedemission,aie)特性的荧光材料引起人们的广泛关注。其特点是该类分子分散状态下不发光，而在聚集状态下才会发出强光。时至今日，aie材料几乎在众多发光材料领域得到应用，特别是在生物体系中的细胞器、病毒或细菌、血管成像等领域表现出越来越多的优势。鉴于这种独特的优点，基于aie的荧光分子，例如四苯基乙烯(tpe)作为疏水片段也广泛地引入到功能材料的设计当中。但目前，将四苯基乙烯引入到pva基的抗菌剂还未见报道。

技术实现要素：

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇。

本发明的另一目的在于提供上述四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇作为抗菌剂的应用。

本发明的四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇克服了季铵盐小分子抗菌剂的缺陷，具有稳定抗菌能力和环境响应性，同时赋予材料对于细菌的长效示踪。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇，具有如下式(i)所述的结构式：

式中x，y，z表示各重复单元的聚合度。

优选地，式(i)中x+y+z＝1932～2818。

上述四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)将聚乙烯醇(pva)溶于有机溶剂中，加入活化剂n,n'-羰基二咪唑(cdi)进行活化，随后加入n,n-二乙基乙二胺(deeda)进行反应，除杂、沉淀、纯化、干燥后得到二乙基乙二胺改性的聚乙烯醇(pva-deeda)；

(2)将pva-deeda溶于有机溶剂，然后加入溴甲基四苯基乙烯(tpe-ch2br)加热反应，沉淀，纯化，干燥，得到四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇(pva-tpe)。

上述制备方法的反应路线如下式所示：

优选地，步骤(1)中所述聚乙烯醇的重均分子量为85000～124000。

优选地，步骤(1)中所述有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)。

优选地，步骤(1)中所述反应温度为22℃，反应时间为20～36h。

优选地，步骤(1)中所述除杂是向溶液中加入氨水溶液，除去未反应的活化剂n,n'-羰基二咪唑(cdi)；所述沉淀是指在丙酮中沉淀；所述纯化是指将沉淀物用水溶解，然后透析，得到纯化产物；所述干燥为冷冻干燥。

优选地，步骤(1)中pva中羟基摩尔量与活化剂cdi的比为1:(0.4～0.6)；pva中羟基摩尔量与deeda的摩尔比为1:(0.4～0.6)。

优选地，步骤(2)中所述有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)。

优选地，步骤(2)中pva-deeda与tpe-ch2br的摩尔比为1:(0.005～0.015)。

优选地，步骤(2)中所述加热反应是指在50～70℃加热反应24～36h。

优选地，步骤(2)中所述沉淀的沉淀剂为丙酮；所述纯化是指将沉淀物用水溶解，然后透析，得到纯化产物；所述干燥为冷冻干燥。

上述四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇作为抗菌剂的应用。

本发明首先以聚乙烯醇(pva)为主链，利用n,n'-羰基二咪唑(cdi)将pva进行活化形成中间体，然后与带有伯胺的亲核性物质n,n-二乙基乙二胺(deeda)对其进行改性，得到具有亲水性酰胺(-co-nh-)和疏水性乙胺基团的聚乙烯醇。这两部分交替地控制聚合物在水溶液中的性质，使其具有温度和ph响应。然后通过叔乙胺基团与带有溴甲基的四苯基乙烯分子(tpe-ch2br)进一步季胺化反应制备得到tpe标记的集温度、ph响应的季胺盐类聚乙烯醇。四苯基乙烯(tpe)分子具有聚集诱导发光(aie)性质，该季胺盐类聚乙烯醇可有效控制季胺盐和tpe标记的百分比含量。

本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：

(1)本发明合成原料廉价易得，合成反应条件温和，反应时间短，工艺操作简单，生产成本低。

(2)本发明的四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇具有温度和ph双重响应(包含生理环境温度)，可通过控制比例进行相变温度调节。同时兼具聚集诱导发光(aie)性质，具有优异的细胞以及细菌成像功能，是一种良好的生物功能材料。

(3)本发明的四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇具有优异的抗菌性能、杀菌速率快、抗菌效率高。低浓度即对金黄色葡萄球菌的抗菌率达到99％以上，同时可实现细菌的原位杀灭与成像。

(4)本发明的四苯基乙烯标记的响应性季铵盐化聚乙烯醇具有很好的水溶性，作为抗菌剂使用过程中无需加入有机溶剂助溶，安全方便。

附图说明

图1为实施例1所用聚乙烯醇(pva)、改性后聚乙烯醇(pva-deeda)和成功接枝aie分子聚乙烯醇(pva-tpe)的核磁谱图；

图2为实施例1所得pva-tpe的ph响应实验结果图；

图3为实施例1所得pva-tpe的细胞毒性实验结果图；

图4为实施例1所得pva-tpe的抗菌实验结果图；

图5为实施例1所得pva-tpe的细菌成像结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)制备pva-deeda：将聚乙烯醇(5.0g，羟基摩尔量为0.12mol)溶于100mldmso，90℃搅拌溶解。完全溶解后，降到室温，将cdi(7.8g，0.048mol)加入到上述溶液中活化3小时，随后向上述溶液缓慢加入deeda(6.7ml，0.048mol)22℃反应20小时。加入50ml25％的氨水溶液，搅拌1小时，除去未反应的cdi。结束反应，在丙酮中沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干获得改性聚乙烯醇。聚乙烯醇的重均分子量优选为85000～124000。

(2)制备pva-tpe：步骤(1)得到的pva-deeda(600mg，16.4mmol)溶于12mldmso中，搅拌，直至完全溶解，随后加入tpe-ch2br(35mg，0.082mmol)，70℃加热反应24小时，丙酮沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干即得pva-tpe。

对本实例制备的pva-deeda、pva-tpe进行核磁测试，结果见图1。

对本实例制备的pva-tpe进行ph响应性表征，结果见图2。

对本实例制备得到的pva-tpe进行细胞毒性表征，选取小鼠成纤维细胞(l929cells)进行实验。将l929细胞以5×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，在5％co2、37℃条件下培养24小时，弃培养基，加入含不同浓度pva-tpe的培养基溶液继续培养48小时，除去培养基，pbs润洗细胞三次，每孔加入100μlcck-8工作液，并将细胞进一步培养1小时，使用酶标仪在450nm处测量每孔吸光度并计算细胞存活率。结果见图3。该结果表明本实例制备的聚乙烯醇季铵盐材料具有很好的生物相容性。

对于本例中制备得到的pva-tpe进行抗菌性能研究。所有细菌的实验耗材均采用高温高压灭菌处理，防止外援细菌对实验结果产生影响。lb培养基与lb营养琼脂按照说明书溶解于去离子水中，然后使用灭菌锅进行灭菌。灭菌后，lb培养基置于4℃冰箱中保存；lb营养琼脂倒入一次性培养皿中布板，待冷却凝固后，收集并保存于4℃冰箱中。

细菌的培养中，首先用接种针挑取少量的细菌金黄色葡萄球菌(atcc29213)和大肠杆菌(atcc15224)加入到15mllb培养基中，37℃下置于摇床中培养(220rpm)，置细菌达到中等浓度。将菌液进行梯度稀释，并涂附于琼脂板上。将涂附后的琼脂板置于37℃霉菌培养箱过夜孵育，直至琼脂板表面长出菌落。选取菌落浓度合适的琼脂板，利用接种针挑取单个菌落，置于15ml摇菌管内，加入3-5ml新鲜lb培养基，37℃下置于摇床中培养(220rpm)5小时，使细菌浓度达到中等水平。

将不同浓度的pva-tpe溶液置于1.5ml离心管中，每个孔中加入200μl稀释浓度为10⁶cfu/ml的细菌菌液，37℃下置于摇床150rpm中培养2小时。2小时后，菌液梯度稀释，并分别取10μl涂附于琼脂培养板上，然后将其置于霉菌培养箱内过夜培养，待菌落大小合适时，选取合适浓度梯度的琼脂培养板进行细菌计数。结果见图4。该结果表明相较于革兰氏阴性菌，材料对于革兰氏阳性菌具有更好的抗菌性。

对本实例制备的pva-tpe进行细菌成像表征。选取金黄色葡萄球菌(atcc29213)进行实验，将pva-tpe溶液置于1.5ml离心管中，每个孔中加入200μl稀释浓度为10⁶cfu/ml的细菌菌液，37℃下置于摇床150rpm中培养2小时，将混合液滴在激光共聚焦皿上，用于激光共聚焦显微镜观察。其细菌成像结果见图5。该结果表明材料对革兰氏阳性菌具有良好的细菌成像功能。

实施例2

(1)制备pva-deeda：将聚乙烯醇(5.0g，羟基摩尔量为0.12mol)溶于100mldmso，90℃搅拌溶解。完全溶解后，降到室温，将cdi(9.2g，0.06mol)加入到上述溶液中中活化3小时，随后向上述溶液缓慢加入deeda(8ml，0.06mol)22℃反应20小时。加入50ml25％的氨水溶液，搅拌1小时，除去未反应的cdi。结束反应，在丙酮中沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干获得改性聚乙烯醇。聚乙烯醇的重均分子量优选为85000～124000。

(2)制备pva-tpe：步骤(1)得到的pva-deeda(600mg，16.4mmol)溶于12mldmso中，搅拌，直至完全溶解，随后加入tpe-ch2br(35mg，0.082mmol)，70℃加热反应24小时，丙酮沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干即得pva-tpe。

实施例3

(1)制备pva-deeda：将聚乙烯醇(5.0g，羟基摩尔量为0.12mol)溶于100mldmso，90℃搅拌溶解。完全溶解后，降到室温，将cdi(11.7g，0.072mol)加入到上述溶液中活化3小时，随后向上述溶液缓慢加入deeda(10ml，0.072mol)22℃反应20小时。加入50ml25％的氨水溶液，搅拌1小时，除去未反应的cdi。结束反应，在丙酮中沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干获得改性聚乙烯醇。聚乙烯醇的重均分子量优选为85000～124000。

(2)制备pva-tpe：步骤(1)得到的pva-deeda(600mg，16.4mmol)溶于12mldmso中，搅拌，直至完全溶解，随后加入tpe-ch2br(35mg，0.082mmol)，70℃加热反应24小时，丙酮沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干即得pva-tpe。

实施例4

(1)制备pva-deeda：将聚乙烯醇(5.0g，羟基摩尔量为0.12mol)溶于100mldmso，90℃搅拌溶解。完全溶解后，降到室温，将cdi(9.2g，0.06mol)加入到上述溶液中活化3小时，随后向上述溶液缓慢加入deeda(8ml，0.06mol)，22℃反应20小时。加入50ml25％的氨水溶液，搅拌1小时，除去未反应的cdi。结束反应，在丙酮中沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干获得改性聚乙烯醇。聚乙烯醇的重均分子量优选为85000～124000。

(2)制备pva-tpe：步骤(1)得到的pva-deeda(600mg，16.4mmol)溶于12mldmso中，搅拌，直至完全溶解，随后加入tpe-ch2br(70mg，0.164mmol)，70℃加热反应24小时，丙酮沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干即得pva-tpe。

实施例5

(1)制备pva-deeda：将聚乙烯醇(5.0g，羟基摩尔量为0.12mol)溶于100mldmso，90℃搅拌溶解。完全溶解后，降到室温，将cdi(9.2g，0.06mol)加入到上述溶液中活化3小时，随后向上述溶液缓慢加入deeda(8ml，0.06mol)，22℃反应20小时。加入50ml25％的氨水溶液，搅拌1小时，除去未反应的cdi。结束反应，在丙酮中沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干获得改性聚乙烯醇。聚乙烯醇的重均分子量优选为85000～124000。

(2)制备pva-tpe：步骤(1)得到的pva-deeda(600mg，16.4mmol)溶于12mldmso中，搅拌，直至完全溶解，随后加入tpe-ch2br(105mg，0.246mmol)，70℃加热反应24小时，丙酮沉淀，将沉淀物溶于去离子水中，透析3天，冻干即得pva-tpe。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。