一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法与流程

本发明涉及dna重组技术、蛋白质的表达方法，尤其是涉及利用家蚕杆状病毒表达系统表达生产重组蓖麻毒素蛋白a链的方法。

背景技术：

蓖麻毒素是从蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64,000。毒素由a和b两条多肽链组成，两链间由一个二硫键连接。目前，a链和b链的氨基酸序列以及二级结构已清楚。毒素a链由263个氨基酸组成，分子量大小32kda，毒素b链上含有两个半乳糖或半乳糖残基结合位点，可和细胞表面的含半乳糖残基的受体结合，通过内陷作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素a、b链上还分别含有1和2个糖支链，链末端均为甘露糖残基，可以和网状内皮细胞特别是巨噬细胞结合。后者细胞表面富含甘露糖受体，可优先摄取蓖麻毒素，这对于毒素发挥生物功能有重要的作用。

蓖麻该毒素易损伤肝、肾等实质器官，发生出血、变性、坏死病变。并能凝集和溶解红细胞，抑制麻痹心血管和呼吸中枢，是致死的主要原因之一。但目前最新的研究发现，该毒素具有诱导细胞凋亡的作用，因此，通过靶向作用，该毒素在肿瘤治疗领域有很好的应用前景。

鉴于该毒素在蓖麻中的含量极低，加上提纯难度大，因此，十分有必要进行体外表达，开发一种高效且经济的方法进行生产。由于该毒素毒性大，一般的表达系统，如大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等表达水平较低，另外由于该蛋白需要糖基化，大肠杆菌等原核表达系统修饰差，所以在上述系统中的表达均不理想。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白a链的方法，以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白a链，利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕内表达该毒素蛋白a链。具体是利用bmnpv构建含有蓖麻毒素蛋白a链基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，表达生产重组蓖麻毒素蛋白a链，具有成本低、表达水平高的特点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下：

(1)蓖麻毒素蛋白a链编码基因的克隆：以蓖麻籽抽提获得的总rna为模板，利用rt-pcr系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白a链基因的pcr产物；

(2)含有蓖麻毒素蛋白a链基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶bamhi和hindiii消化pcr2.1-蓖麻毒素蛋白a链得到蓖麻毒素蛋白a链基因片段，然后将蓖麻毒素蛋白a链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pbluebachisa获得重组体pbluebachisa-蓖麻毒素蛋白a链；通过共转染在家蚕培养细胞bmn内将重组体pbluebachisa-蓖麻毒素蛋白a链与家蚕核型多角体病毒(bmnpv)的基因同源重组产生重组病毒；

(3)家蚕体内表达重组蓖麻毒素蛋白a链：使用家蚕幼虫5龄起蚕，经口接种上述重组病毒进行感染表达，将涂布有病毒液的桑叶饲喂家蚕，然后在23-25℃下饲养；在饲养96小时后收集家蚕幼虫；从家蚕幼虫中收集血淋巴，用ni-nta亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得最终的重组蓖麻毒素蛋白a链蛋白。

所述步骤(1)中，利用rt-pcr系统一步克隆具体如下：引物设计如下：正向引物：5'-agggatccccattccccaaata-3'，含有bamhi酶切位点，反向引物：5'-gaagctttaaaaactgtgacgatggt-3'，含有hindiii酶切位点；pcr反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性2分钟；10个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；25个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；然后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分析，并用pcr纯化试剂盒纯化，随后将pcr产物克隆入载体pcr2.1，获得pcr2.1-蓖麻毒素蛋白a链。

所述步骤(1)中，载体pcr2.1为invitrogen公司的ta克隆3.9kb的载体pcr2.1。

所述步骤(2)具体为：在离心管中加入1μg的pbluebachisa-蓖麻毒素蛋白a链dna和15μg的家蚕核型多角体病毒(bmnpv)dna，混匀，并加入14μl的脂质体(lipofectin)，再加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；然后将混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的bmn培养细胞，用无血清的tc-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基在27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，用病毒储存原液通过空斑筛选，最终获得重组病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml。

所述步骤(2)中，以家蚕幼虫的血淋巴作为重组蓖麻毒素蛋白a链纯化的起始材料，具体使用以下方法从家蚕幼虫中收集血淋巴：收集管预先加入占据收集管1/10体积的10mmol/l的二硫苏糖醇dtt(分子式为c4h10o2s2)，在收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边；用25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中。

所述步骤(2)中，用ni-nta亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，具体为：将收集的血淋巴用非变性结合缓冲液进行稀释，非变性结合缓冲液含有na3po450mmol/l、nacl0.5mol/l且ph8.0，稀释后将溶液结合于ni-nta亲和柱，再在非变性结合缓冲液中加入250mmol/l咪唑获得非变性洗脱缓冲液，用非变性洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液作为重组蓖麻毒素蛋白a链蛋白的溶液。

本发明与背景技术相比，具有的有益效果是：

本发明较好地解决了蓖麻毒素蛋白a链由于毒性大难以在大肠杆菌、酵母等中表达的瓶颈，而且在家蚕幼虫中表达具有安全、表达水平高的优点，且大部分被分泌进血淋巴中，非常有利于蛋白质的快速提取。

本发明为重组蓖麻毒素蛋白a链的大量生产以及为蓖麻毒素蛋白a链在肿瘤治疗领域中的应用创造了条件。

附图说明

图1为pbluebachisa质粒组成图；

图2为家蚕内表达与纯化电泳图；

图3为家蚕血液的收集状态图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的具体实施例如下：

1、材料：rna抽提试剂盒购于qiagene。dna处理和pcr扩增试剂盒购于takarabiomedicals(kyoto，japan)。ta克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pbluebachisa、lipofectin和ni-nta树脂均为invitrogen公司产品。dna测序试剂盒购于peappliedbiosystems。家蚕核型多角体病毒bmnpv和家蚕培养细胞bmn由实验室保存。胎牛血清fcs、其培养基tc-100均为gibcobrl的产品。家蚕bmn细胞用添加10％(v/v)fcs的tc-100培养基在27℃培养。本试验使用家蚕商用杂交品种，秋丰×白玉，家蚕幼虫桑叶饲养，温度为23～25℃。

2、实验流程：

1、利用家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白a链的方法，其特征在于：

(1)蓖麻毒素蛋白a链编码基因的克隆：以蓖麻籽抽提获得的总rna为模板，利用rt-pcr系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白a链基因的pcr产物；

利用rt-pcr系统一步克隆具体如下：

引物设计如下：正向引物：5'-agggatccccattccccaaatac-3'，含有bamhi酶切位点，反向引物：5'-gaagctttaaaaactgtgacgatggt-3'，含有hindiii酶切位点；

pcr反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性2分钟；10个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；25个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟。

然后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行pcr产物分析，结果如图2所示，并用pcr纯化试剂盒纯化，随后将pcr产物克隆入invitrogen公司的ta克隆3.9kb的载体pcr2.1，获得pcr2.1-蓖麻毒素蛋白a链，利用dna测序确认克隆后的产物中的蓖麻毒素蛋白a链基因序列正确。

(2)含有蓖麻毒素蛋白a链基因的重组杆状病毒的构建：

用限制性内切酶bamhi和hindiii消化pcr2.1-蓖麻毒素蛋白a链得到蓖麻毒素蛋白a链基因片段，然后将蓖麻毒素蛋白a链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pbluebachisa获得重组体pbluebachisa-蓖麻毒素蛋白a链。

然后通过共转染在家蚕培养细胞bmn内将重组体pbluebachisa-蓖麻毒素蛋白a链与家蚕核型多角体病毒(bmnpv)同源重组产生重组病毒，具体为：在离心管中加入1μg的pbluebachisa-蓖麻毒素蛋白a链dna和15μg的家蚕核型多角体病毒(bmnpv)dna，混匀，并加入14μl的脂质体(lipofectin)，再加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；然后将混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的bmn培养细胞，用无血清的tc-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基在27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，病毒储存原液用来筛选重组病毒，用病毒储存原液通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml。

(3)家蚕体内表达和重组蓖麻毒素蛋白a链：

使用家蚕幼虫5龄起蚕，经口接种上述重组病毒进行感染表达，将涂布有病毒液(浓度为10⁶pfu/ml)的桑叶饲喂家蚕，然后在23-25℃下饲养；饲养96小时后收集家蚕幼虫。具体实施中，感染后饲养的三天内，看不到明显的感染症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡。

从家蚕幼虫中收集血淋巴，收集管预先加入占据收集管1/10体积的10mmol/l的二硫苏糖醇dtt，防止腹足刺破后的血液滴入收集管中氧化变黑，在收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边(参见图3)；用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑收集管已经预先加入占据收集管1/10体积的10mmol/l的二硫苏糖醇dtt，使二硫苏糖醇终浓度为1mmol/l。

用ni-nta亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，将收集的血淋巴用非变性结合缓冲液进行稀释，非变性结合缓冲液含有na3po450mmol/l、nacl0.5mol/l且ph8.0，稀释后将溶液结合于ni-nta亲和柱，再在非变性结合缓冲液中加入250mmol/l咪唑获得非变性洗脱缓冲液，用非变性洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液作为重组蓖麻毒素蛋白a链蛋白的溶液。

获得最终的重组蓖麻毒素蛋白a链蛋白。

具体实施进一步通过sds-page考马斯亮蓝染色后根据分子量大小鉴定重组蛋白。

经实施测试，应用提取出的蓖麻毒素a链对小白鼠做活性实验，结果表明，蓖麻毒素a链对小鼠腹腔注射的ld_(50)为9ug/kg，发现获得的重组蓖麻毒素蛋白a链具有生物学活性。

本发明实施例结果显示，生产表达了具有生物活性的重组蓖麻毒素蛋白a链，经过蛋白质电泳分析表明，家蚕幼虫表达的重组蓖麻毒素蛋白a链大部分被分泌进血淋巴中，这非常有利于蛋白质的快速提取。

实验结果证明利用重组杆状病毒在家蚕内表达重组蓖麻毒素蛋白a链可行。重组蓖麻毒素蛋白a链的大量生产为该蛋白a链在医学和治疗领域上的应用提供了工业生产途径。