本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于区分不同生态型丁香的est-ssr标记及所用引物。
背景技术：
丁香(syringa)为木犀科(oleaceae)丁香属(syringa)多年生木本植物的统称，在中国已有1000多年的栽培历史，是中国的名贵花卉。全世界丁香属植物约有27种，我国丁香属植物大约有22种，其中18种为特有种。丁香在中国的分布主要集中在西南、西北、华北和东北等地区，其中四川、云南及西藏等地有13种自然分布的丁香，也是我国丁香的特有种最多的地方。丁香以浓郁的花香而闻名，其植株清雅秀丽、花繁色丽、花序簇成圆锥状，习性强健，栽培简易，深受世人的喜爱，是我国优良的园林绿化植物，在园林绿化中广泛应用。随着丁香产业的快速发展，丁香种质资源的深度挖掘与创新越来越受到人们的关注，市场上对其新品种的需求也十分迫切。先前，国内外学者对于丁香的研究主要集中在其化学成分、药理活性、栽培繁殖技术和传统杂交育种等方面，而从分子层次研究其遗传多样性则相对较少。
dna(deoxyribonucleicacid)分子标记，是以基因组dna多态性为基础的一种新型标记，不仅能够稳定遗传，而且可以直接反映生物个体遗传变异结构。近年来，已先后产生了20多种分子标记，它的出现大大加快了遗传学和功能基因组学的发展，有望成为加速植物育种研究的强有力工具。简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)又称微卫星(microsatellite)标记，是由1-6个寡核苷酸组成的基序串联重复而成的dna碱基序列。在众多分子标记中，ssr标记由于具有共显性、变异丰富且易检测等优点被认为是理想的分子标记类型之一，广泛应用于人类医学、动植物及微生物领域。目前，有关丁香属ssr标记开发也有所报道，其原始序列来源于公共数据库中有限的表达序列或基因组数据，因而开发得到的ssr标记数量非常少，目前仅有16对丁香属ssr标记，远远不能满足丁香属种质资源遗传多样性评价、遗传连锁图谱构建、功能基因定位及关联分析研究等的需求。因此，开发丁香属ssr分子标记成为亟待解决的关键问题。
ssr标记依据来源不同可以分为两类：基因组ssr(genomicsssr,gssr)和表达序列标签ssr(expressedsequencetagssr,est-ssr)。gssr位于基因组的编码区和非编码区，标记的开发以基因文库构建法(包括ssr富集文库)为主，其实验过程繁杂、费时费力、效率较低。近些年，数据库中急剧增长的est资源以其简单快速、成本低，来源于表达的基因组区域、可直接反映相关基因的多样性，且在不同种、属甚至科的物种间具有良好的通用性等优势已成为ssr标记的重要来源。高通量转录组测序技术能够以较低的成本，在较短的时间内获得海量的分子信息，为大规模开发ssr标记提供了一种简单而有效的方法，尤其适合于缺乏基因组信息的非模式植物。
技术实现要素：
本发明的目的是一种区分丁香生态型的方法及所用引物。
本发明首先提供了鉴定丁香基因型的方法，所述方法包括：利用引物组对待测丁香的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物，检测各引物对pcr产物的大小，确定所述待测丁香的基因型；
所述引物组包括so026、so029、so035、so040、so046、so100、so176、so178、so194、so197、so222、so244、so403、so424、so432、so448、so464、so509、so518、so532、so872和so922中的至少一种；
所述so026为由序列表中序列1和2所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so029为由序列表中序列3和4所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so035为由序列表中序列7和8所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so040为由序列表中序列9和10所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so046为由序列表中序列11和12所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so100为由序列表中序列13和14所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so176为由序列表中序列17和18所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so178为由序列表中序列19和20所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so194为由序列表中序列21和22所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so197为由序列表中序列23和24所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so222为由序列表中序列25和26所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so244为由序列表中序列27和28所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so403为由序列表中序列31和32所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so424为由序列表中序列33和34所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so432为由序列表中序列35和36所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so448为由序列表中序列37和38所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so464为由序列表中序列39和40所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so509为由序列表中序列41和42所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so518为由序列表中序列43和44所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so532为由序列表中序列45和46所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so872为由序列表中序列47和48所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so922为由序列表中序列49和50所示的两条单链dna组成的引物对。
所述引物组还可包括so033、so101和so329中的至少一种；
所述so033为由序列表中序列5和6所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so101为由序列表中序列15和16所示的两条单链dna组成的引物对；
所述so329为由序列表中序列29和30所示的两条单链dna组成的引物对。
所述引物组可由所述so026、所述so029、所述so035、所述so040、所述so046、所述so100、所述so176、所述so178、所述so194、所述so197、所述so222、所述so244、所述so403、所述so424、所述so432、所述so448、所述so464、所述so509、所述so518、所述so532、所述so872和所述so922中的全部组成。
所述引物组还可由所述so026、所述so029、所述so035、所述so040、所述so046、所述so100、所述so176、所述so178、所述so194、所述so197、所述so222、所述so244、所述so403、所述so424、所述so432、所述so448、所述so464、所述so509、所述so518、所述so532、所述so872、所述so922、所述so033、所述so101和所述so329中的全部组成。
所述so026、所述so029、所述so035、所述so040、所述so046、所述so100、所述so176、所述so178、所述so194、所述so197、所述so222、所述so244、所述so403、所述so424、所述so432、所述so448、所述so464、所述so509、所述so518、所述so532、所述so872、所述so922、所述so033、所述so101和所述so329均可标记有荧光物质。荧光物质可标记在各引物对正向引物的5'端。各引物对所标记的荧光物质可为fam。序列表中序列号为奇数的单链dna为正向引物，序列号为偶数的单链dna为反向引物。
进行pcr扩增时，所述so026的退火温度可为48℃；所述so029的退火温度可为48℃；所述so035的退火温度可为50℃；所述so040的退火温度可为50℃；所述so046的退火温度为50℃；所述so100的退火温度可为50℃；所述so176的退火温度可为52℃；所述so178的退火温度可为52℃；所述so194的退火温度可为52℃；所述so197的退火温度可为52℃；所述so222的退火温度可为52℃；所述so244的退火温度可为52℃；所述so403的退火温度可为52℃；所述so424的退火温度可为54℃；所述so432的退火温度可为54℃；所述so448的退火温度可为54℃；所述so464的退火温度可为54℃；所述so509的退火温度可为54℃；所述so518的退火温度可为54℃；所述so532的退火温度可为54℃；所述so872的退火温度可为56℃；所述so922的退火温度可为60℃；所述so033的退火温度可为48℃；所述so101的退火温度可为50℃；所述so329的退火温度可为52℃。
进行pcr扩增时，每对引物分别单独进行。各单链dna在pcr扩增反应体系中的浓度可为10μm。各引物对的10μl反应体系均可为：模板(25ng)1μl，2×powertaqpcrmastermix(北京艾德莱生物科技有限公司，货号：pc09)5μl，正反向引物各0.5μl，ddh2o3μl。
进行pcr扩增的反应条件均可为：95℃预变性5min；95℃变性30s，各自退火温度30s，72℃延伸1min，30-35个循环；72℃延伸10min。
所述基因型可体现在上述各引物对以丁香基因组dna进行pcr扩增得到的est-ssr标记上。
所述鉴定丁香基因型的方法在鉴定丁香等位基因多态性或丁香变体或丁香生态型中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在鉴定丁香种群中相同或相关基因型中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在研究丁香种群遗传多样性中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在丁香种质资源遗传多样性评价中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在丁香种质资源的分类和/或鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在丁香杂种早期鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在丁香遗传连锁图谱构建中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述鉴定丁香基因型的方法在丁香分子标记辅助育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述引物组，所述引物组可用于鉴定丁香基因型。
由所述引物组以丁香基因组dna进行pcr扩增得到的est-ssr标记，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在鉴定丁香等位基因多态性或丁香变体或丁香生态型中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在鉴定丁香种群中相同或相关基因型中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在研究丁香种群遗传多样性中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在丁香种质资源遗传多样性评价中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在丁香种质资源的分类和/或鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在丁香杂种早期鉴定中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在丁香遗传连锁图谱构建中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述引物组或所述est-ssr标记在丁香分子标记辅助育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了区分两种待测丁香是否为同一生态型的方法，所述方法包括：利用所述引物组对两种待测丁香的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物，比较两种待测丁香各引物对pcr产物的大小，所述引物组中每一对引物pcr扩增产物的大小均相同的两种待测丁香为或候选为同一生态型，所述引物组中至少一对引物pcr扩增产物的大小不同的两种待测丁香为或候选为不同生态型。
所述丁香可为丁香属植物。所述丁香具体可为‘金园’丁香、白丁香、暴马丁香、小叶丁香、什锦丁香、羽叶丁香、欧丁香、花叶丁香、华丁香和/或关东丁香。
实验证明，利用本发明的引物组对不同生态型丁香基因组dna进行pcr扩增，所得pcr产物均不相同，具有多态性，可以用于鉴定以所得pcr产物表示的est-ssr决定的丁香基因型，进一步还可用于区分不同丁香生态型。本发明的引物组及est-ssr标记在丁香属内具有较好的应用，可以用于区分丁香属中不同生态型的丁香，为开展丁香及其近缘种的分子标记辅助育种提供了便利。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、用于区分不同生态型丁香的est-ssr标记
本实施例提供了一组可以用于区分不同生态型丁香的est-ssr标记，及可以扩增该组est-ssr标记的一组est-ssr引物，引物信息如表1所示。
表1、25对多态性est-ssr引物信息
表1中序列号为奇数的引物为正向引物，序列号为偶数的引物为反向引物，每对引物进行pcr扩增的10μl反应体系为：模板(25ng/μl)1μl，2×powertaqpcrmastermix(北京艾德莱生物科技有限公司，货号：pc09)5μl，正反向引物各0.5μl(正反向引物在反应体系中的浓度均为10μm)，ddh2o3μl。所用模板均为以丁香叶片位的基因组dna。
pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，各自退火温度30s，72℃延伸1min，30-35个循环；72℃延伸10min。
引物的稳定性：
按照上述反应体系和反应条件，利用表1中的引物分别以3个生态型丁香的叶片部位的基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后利用fluorchemtm5500(alfainnotechcorp.,usa)凝胶成像仪对电泳结果进行观察与记录，结果显示pcr产物条带均清晰、单一，表1中的引物扩增稳定。
所用3个生态型丁香为：3个不同基因型的紫丁香(北京圣泉润清园林绿化科技有限公司)。
引物的多态性：
之后委托北京睿博兴科生物技术有限公司对表1各引物对的正向引物的5'端利用fam进行标记。然后按照上述反应体系和反应条件，以8个生态型丁香叶片部位的基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增后于abi3730dna分析仪上进行毛细管电泳，并收集数据，验证多态性。利用genemarkerversion2.2.0软件分析和读取数据。其中，标准内参为liz600(appliedbiosystems)。所用8个生态型丁香均来自于北京圣泉润清园林绿化科技有限公司。
结果显示，表1中的25对引物在不同生态型丁香间具有多态性，即每个丁香的25对引物的pcr扩增产物均不完全相同。
引物的通用性：
利用将表1的引物进行荧光标记后的引物分别以10个生态型丁香的叶片部位的基因组dna为模板按照上述反应体系和反应条件进行pcr扩增，将得到的pcr产物进行毛细管电泳检测，利用genemarkerversion2.2.0软件分析和读取数据，得到各品种的指纹数据。其中，标准内参为liz600(appliedbiosystems)。
所用10个生态型丁香为：‘金园’丁香、白丁香、暴马丁香、小叶丁香、什锦丁香、羽叶丁香、欧丁香、花叶丁香、华丁香和关东丁香。
‘金园’丁香记载在文献“郭翎,孙宜,崔纪如.北京丁香新品种'金园'[j].林业科学,2008,44(1).”中。
白丁香、暴马丁香、羽叶丁香、欧丁香、花叶丁香、华丁香记载在文献“陈西仓,裴娟芳.甘肃丁香属植物资源及开发利用[j].特种经济动植物,2017(5).”中。
小叶丁香、什锦丁香、关东丁香记载在文献“孟昕.北京地区丁香属种质资源收集以及园林应用[j].北京园林,2011(2):35-42.”中。
结果显示，所有引物在‘金园’丁香、白丁香、暴马丁香、小叶丁香、什锦丁香、羽叶丁香、欧丁香具有100％的通用性，即均可扩增到pcr产物，且产物间具有多态性；so101和so329引物未能在花叶丁香中成功扩增到pcr产物；so033未能在华丁香中成功扩增到pcr产物。10个种的扩增率范围在92.0％-100.0％，平均扩增率98.8％。因此本发明的est-ssr引物及est-ssr标记在丁香属内具有较好的应用，可以用于区分丁香属中不同生态型的丁香，为开展丁香及其近缘种的分子标记辅助育种提供了便利。
区分不同生态型丁香的方法包括：
利用表1中的25对引物分别对两种待测丁香的基因组dna进行pcr扩增，得到各待测丁香的pcr扩增产物，比较各待测丁香25对引物中每一对引物pcr扩增产物的大小，25对引物中每一对引物pcr扩增产物的大小均相同的两种待测丁香为相同生态型丁香，25对引物中至少一对引物pcr扩增产物的大小不同的两种待测丁香为不同生态型丁香。
本发明还可以利用表1中的25对引物判断待测丁香是否与下述标准丁香为同一生态型：‘金园’丁香、白丁香、暴马丁香、小叶丁香、什锦丁香、羽叶丁香、欧丁香、花叶丁香、华丁香、关东丁香，该方法包括：
利用表1中的25对引物对待测丁香进行pcr扩增，得到待测丁香的pcr扩增产物，比较待测丁香与标准丁香中各丁香25对引物中每一对引物pcr扩增产物的大小，如待测丁香与标准丁香中某一丁香的25对引物的pcr扩增产物的大小均相同，则该待测丁香与该丁香为相同生态型，如待测丁香与标准丁香中任一丁香的25对引物pcr扩增产物的大小均不完全相同，则待测丁香不为标准丁香中任一种生态型。
序列表
<110>北京农学院
<120>用于区分不同生态型丁香的est-ssr标记及所用引物
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