检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的特异性引物探针组合及其应用。

背景技术：

糖肽类抗生素是链霉菌或者放线菌产生的一种具有七肽骨架的线性多肽类抗生素，其抑菌机制主要是通过结合细菌细胞壁合成过程中的d-ala-d-ala，抑制细胞壁合成从而抑制细菌的生长和繁殖。万古霉素作为四大糖肽类抗生素之一，于1958年首次分离得到，主要针对只具有肽聚糖层结构细胞壁的革兰氏阳性细菌和螺旋体，所以在其发明的前20年内只作为备选药物。随着甲氧西林耐药金葡菌的出现，万古霉素才开始作为抗感染的首选药物。随着万古霉素在世界范围内大量应用，出现了耐万古霉素的肠球菌和金黄色葡萄球菌，人们先后又发明了药效更强的万古霉素二代和万古霉素三代，其药效比第一代有较大提高。

糖肽类抗生素耐药性的产生主要是由于细菌对糖肽类抗生素敏感结合的d-ala-d-ala靶点进行了修饰改变(如：d-ala-d-lac，d-ala-d-ser，d-ala)，大大削弱了万古霉素的靶向能力。从基因组的层面研究，糖肽类抗生素的耐药性主要由是13种操纵子引起，除vanf，vani，vanj，vano外，其他9种操纵子(vana、vanb、vanc、vand、vane、vang、vanl、vanm和vann)均来自肠球菌。

vanf操纵子发现于paenibacilluspopilliae，其组成与vana、vanb操纵子类似，耐药机制也是通过将肽聚糖前体c端d-ala替换为d-lac，降低糖肽类药物与肽聚糖前体的亲和力，表现出对万古霉素可诱导的高水平耐药，而对替考拉宁表现为敏感或低水平耐药。vani操纵子发现于desulfitobacteriumhafniense，具有中到高水平的万古霉素抗性和中水平的替考拉宁抗性。vanj操纵子发现于streptomycescoelicolor，包含vanrsjkhax基因簇，其中vankhax基因簇编码的酶介导了对万古霉素的抗性；而vanj基因编码一种膜蛋白，可降解宿主产生的高亲和力肽聚糖前体，单独介导了对替考拉宁的抗性。vano操纵子分离自rhodococcusequi，经万古霉素诱导可以产生d-ala-d-lac从而引起耐药，其序列与肠球菌中的9种操纵子同源性均低，包含vanhox基因簇，以及orf1,orf2,和orf3三个功能基因。

首次发现的携带vanf，vani，vanj，vano耐药操纵子的菌株均来自环境微生物菌群，特别是畜、禽、水产等养殖场所，以及土壤、水体等环境中，这与糖肽类抗生素用于养殖业防止动物疫病紧密相关。近来，携带vani操纵子的耐药菌株在人类肠道中已有发现，说明相关耐药基因在不同细菌间发生了水平转移，耐药基因有扩散的趋势。细菌耐药基因在药物选择的压力下迅速爆发，对环境、公共卫生和临床医疗都造成了巨大危害。因此，高特异性的耐药基因检测势在必行。

糖肽类药物耐药性现有的检测方法主要有表型和基因型两类，表型检测通过药物选择下的抑菌圈大小或半致死浓度衡量，存在方法繁琐，耗时较长且检测的假阴性高等弊端。基因型检测则通过检测细菌是否携带相关耐药基因实现，相比表型检测，准确率高，耗时较短价格相对较低，是国际研究和临床应用的主要手段。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano的引物探针组合及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供特异性检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因(vanf、vani、vanj和vano)的引物探针组合：

包括对四种糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano进行特异性扩增的引物组合，所述引物如序列1-8所示；

还包括检测四种不同糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano的特异性探针组合，所述探针如序列9-12所示。

所述的引物组合由引物组1-4组成；所述的引物组1包括vanf基因特异性引物，具体为vanf基因正向引物(序列1)和vanf基因反向引物(序列2)；所述的引物组2包括vani基因特异性引物，具体为vani基因正向引物(序列3)和vani基因反向引物(序列4)；所述的引物组3包括vanj基因特异性引物，具体为vanj基因正向引物(序列5)和vanj基因反向引物(序列6)；所述的引物组4包括vano基因特异性引物，具体为vano基因正向引物(序列7)和vano基因反向引物(序列8)。

本发明设计的引物组合具有相同的参数范围，以保证各组引物在相同的反应条件下都能正常工作。具体为：引物长度范围在15-25个寡核苷酸之间，最优为20个寡核苷酸；引物tm值范围在45-65℃之间，最优为56℃；正向、反向引物之间tm值最多相差3℃，最优为0℃；pcr产物长度范围在100-1000bp之间，最优为200-400bps。

所述的探针组合由探针1-4组成；所述的探针1包括vanf基因特异性探针(序列9)；所述的探针2包括vani基因特异性探针(序列10)；所述的探针3包括vanj基因特异性探针(序列11)；所述的探针4包括vano基因特异性探针(序列12)。

本发明设计的探针具有相同的参数范围，以保证各个探针在相同的反应条件下都能正常工作。具体为：探针长度范围在15-30个寡核苷酸之间，最优为20个寡核苷酸；探针的杂交温度范围在48-70℃之间，最优为56℃；探针的gc含量范围在20％-80％之间，最优为50％。

所述引物和探针具体如下表1所述。

表1

所述引物组合中，所述引物组1、2、3、4的摩尔比可为1:1:1:2。

所述探针组合中，所述探针1、2、3、4在杂交反应中应等量应用。

本发明还同时提供了一种特异性检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的试剂盒：包括如上表1所述的引物组合(其序列如序列1-8所示)和特异性探针组合(其序列如序列9-12所示)。

作为本发明的试剂盒的改进：还可包含pcr扩增反应液和杂交反应液。

注：所述的pcr扩增反应液和/或杂交反应液可以是商品化的pcr扩增反应液和/或杂交液，也可以是符合pcr扩增和杂交反应原理的自制反应液。

本发明还同时提供了引物探针组合/试剂盒的应用，为以下任一用途：

1)、用于鉴定耐药基因vanf、vani、vanj和vano中的至少一种(即，为任意一种，或任意2种、3种、4种的组合)；

2)、检测待测菌是否含有糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano中的至少一种；

3)、检测待测样本中是否含有糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano中的至少一种。

作为本发明应用的改进：

1)、提取待测样本/待测菌的总dna；

2)、以步骤1)提取的总dna为模板，采用特异性引物组合进行pcr扩增；

3)、将步骤2)所得的pcr扩增产物与所述的特异性探针分别进行杂交，然后如下进行判断：

如果探针的杂交结果为阳性，则该阳性探针所对应的耐药基因存在于该待测样本/待测菌中。

即，如果所述的特异性探针组合中，有一条或多条探针的杂交结果为阳性，则该阳性探针所对应的耐药基因存在于该待测菌(或待测样本)中；如果所述的特异性探针组合的杂交结果均为阴性，则该待测菌(或待测样本)中不存在所述的四种糖肽类药物耐药基因中的任何一种。

作为本发明应用的进一步改进：

待测的四种糖肽类药物耐药基因为：vanf、vani、vanj和vano。

所述的待测样本可以是含有细菌的环境样本(土壤、水体等)，也可以是来源于人体或动物的样本(粪便、脓液等)。

本发明基于基因型检测，在传统的基因型检测方法pcr的基础上，进一步采用引物和探针结合方式，共同筛选革兰氏阳性菌中vanf，vani，vanj，vano耐药基因。避免了pcr方法存在的仅根据扩增产物片段大小判断结果的不确定性等缺点，比现有的检测手段特异性更高，效率更高，成本更低。细菌耐药基因通常经质粒，转座子等可转移遗传元件在不同菌群间水平传播，其转移和扩散造成细菌耐药性的蔓延和加重，导致抗菌药物失效。

本发明不仅可用于土壤、水体等环境样本，特别是畜、禽、水产等养殖场所中vanf、vani、vanj和vano耐药基因的高特异性、高灵敏度、快速、同步检测，监测相关耐药基因的分布及转移情况，还可用于动物或人体感染样本中vanf、vani、vanj和vano耐药基因的检测，提示对万古霉素、替考拉宁的耐药程度，为抗感染治疗用药提供参考依据，同时对糖肽类药物耐药的发展进行监测。本发明具有重大的推广价值。

综上所述，本发明提供的特异性引物组合和探针组合用于检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano，具有高特异性和涵盖度，不仅可用于土壤、水体等环境样本，特别是畜、禽、水产等养殖场所中vanf、vani、vanj和vano耐药基因的高特异性、高灵敏度、快速、同步检测，监测相关耐药基因的分布及转移情况，还可用于动物或人体感染样本中vanf、vani、vanj和vano耐药基因的检测，提示对万古霉素、替考拉宁的耐药程度，为抗感染治疗用药提供参考依据，同时对糖肽类药物耐药的发展进行监测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的特异性探针点阵排布图；

图2为革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的特异性检测结果图(杂交后)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是限制本发明。

下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。

实施例1、革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的引物组合和探针组合的涵盖度和特异性：

本实施例通过如下步骤对本发明所述的检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的引物组合和探针组合的涵盖度和特异性进行说明。

步骤1：从抗生素耐药权威数据库—抗生素综合耐药数据库(thecomprehensiveantibioticresistancedatabase，card)下载本发明涉及的四种糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano的参考序列：af155139(vanf)、hq433580(vani)、nc_003888(vanj)和kf478993(vano)。

步骤2：将上述四种耐药基因的参考序列分别提交ncbi进行在线blast比对，比对数据库为非冗余核酸数据库(20190315版本)。其中，vanf基因参考序列af155139共获得25条比对序列，vani基因参考序列hq433580共获得15条比对序列，vanj基因参考序列nc_003888共获得47条比对序列，vano基因参考序列kf478993共获得32条比对序列。

步骤3：对上述四种耐药基因的参考序列检索到的比对序列合并，然后进行一一核实，仅保留序列注释分别为vanf、vani、vanj和vano的比对序列，以及基因注释未明确但与参考序列一致性在95％(含)以上的比对序列，组成数据集a；筛选后剩余的比对序列组成数据集b。

数据集a应被认为是截止比对数据库版本日之前，所有已发现并完成测序的vanf、vani、vanj和vano基因的序列集合；数据集b应被认为是截止比对数据库版本日之前，所有已发现并完成测序的与vanf、vani、vanj和vano基因相似度最高的序列集合。

经筛选，数据集a包含25条序列，包括：vanf基因比对序列12条，vani基因比对序列6条，vanj基因比对序列4条，vano基因比对序列3条；数据集b包含94条序列，包括：vanf基因比对序列13条，vani基因比对序列9条，vanj基因比对序列43条，vano基因比对序列29条。

步骤4：将本发明所采用的检测四种糖肽类药物耐药基因的引物组合和探针组合(如表1所述)分别于上述数据集a和b进行比对，结果显示：

本发明所采用的引物组1所含的vanf基因扩增引物与数据集a中12条vanf基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组1所含的vanf基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vanf基因及其突变基因，具有高度的vanf基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组1所含的vanf基因扩增引物对vani、vanj和vano基因，以及与vanf基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vanf基因特异性。

本发明所采用的探针1所含的vanf基因特异性探针序列与数据集a中12条vanf基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针1所含的vanf基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vanf基因及其突变基因，具有高度的vanf基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针1所含的vanf基因特异性探针对vani、vanj和vano基因，以及与vanf基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vanf基因特异性。

本发明所采用的引物组2所含的vani基因扩增引物与数据集a中6条vani基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少5个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组2所含的vani基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vani基因及其突变基因，具有高度的vani基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组2所含的vani基因扩增引物对vanf、vanj和vano基因，以及与vani基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vani基因特异性。

本发明所采用的探针2所含的vani基因特异性探针序列与数据集a中6条vani基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针2所含的vani基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vani基因及其突变基因，具有高度的vani基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针2所含的vani基因特异性探针对vanf、vanj和vano基因，以及与vani基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vani基因特异性。

本发明所采用的引物组3所含的vanj基因扩增引物与数据集a中4条vanj基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组3所含的vanj基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vanj基因及其突变基因，具有高度的vanj基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组3所含的vanj基因扩增引物对vanf、vani和vano基因，以及与vanj基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vanj基因特异性。

本发明所采用的探针3所含的vanj基因特异性探针序列与数据集a中4条vanj基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针3所含的vanj基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vanj基因及其突变基因，具有高度的vanj基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针3所含的vanj基因特异性探针对vanf、vani和vano基因，以及与vanj基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vanj基因特异性。

本发明所采用的引物组4所含的vano基因扩增引物与数据集a中3条vano基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组4所含的vano基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vano基因及其突变基因，具有高度的vano基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组4所含的vano基因扩增引物对vanf、vani和vanj基因，以及与vano基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vano基因特异性。

本发明所采用的探针4所含的vano基因特异性探针序列与数据集a中3条vano基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针4所含的vano基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vano基因及其突变基因，具有高度的vano基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针4所含的vano基因特异性探针对vanf、vani和vanj基因，以及与vano基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vano基因特异性。

实施例2、本发明所述的特异性引物探针组合的检测特异性

本实施例所用的引物和探针，均由上海英骏生物技术有限公司合成。

一、待测样本的制备

本实施例以分别包含四种糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano的质粒dna为待测样本，检验本发明所述的引物探针组合的检测特异性。

上述各质粒的制备方法如下：

待测样本1为包含耐药基因vanf的质粒：将puc18质粒的hindiii和ecori位点之间的序列替换为vanf基因参考序列af155139所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vanf的质粒；

待测样本2包含耐药基因vani的质粒：将puc18质粒的hindiii和ecori位点之间的序列替换为vani基因参考序列hq433580所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vani的质粒；

待测样本3包含耐药基因vanj的质粒：将puc18质粒的hindiii和kpni位点之间的序列替换为vanj基因参考序列nc_003888所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vanj的质粒；

待测样本4包含耐药基因vano的质粒：将puc18质粒的hindiii和ecori位点之间的序列替换为vano基因参考序列kf478993所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vano的质粒；

待测样本5为质粒puc18，不包含vanf、vani、vanj和vano基因中的任何一种，为阴性对照。

上述质粒均通过测序，确定了序列如上所述。

二、引物组合的配制

本发明所述的引物组合包括引物组1-4，分别用于检测vanf、vani、vanj和vano基因。

本实施例所用的引物是在本发明所述的特异性引物组中的反向引物序列(即序列2、4、6、8)的5’-末端加上一段与待测基因完全没有同源性的无关序列(本实施例采用的是来源于模式植物拟南芥的序列片段)，并标记荧光分子。使得反向引物在pcr扩增过程中的较高退火温度下仍可以继续扩增，并使得扩增产物单链末端携带荧光分子，该单链产物与特异性探针杂交后，使得特异性探针所在位置显示出荧光。

本实施例所用的引物序列如下：

用于检测vanf基因的引物组1包括(5’-3’)：

正向引物(序列1)：

gctgtaaaggtctttctcgt；

反向引物(序列2修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-cagccatcatacggggata；

用于检测vani基因的引物组2包括(5’-3’)：

正向引物(序列3)：

atgactcgaaggtgctgat；

反向引物(序列4修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-tttcagaaacatatccacccg；

用于检测vanj基因的引物组3包括(5’-3’)：

正向引物(序列5)：

gttcggtctgttcgtccc；

反向引物(序列6修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-gtgtggtacggatactccc；

用于检测vano基因的引物组4包括(5’-3’)：

正向引物(序列7)：

gttcatctttcggcgtcag；

反向引物(序列8修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-catggtgttgacctcgttg。

本实施例对本发明所述的特异性引物进行上述修饰，目的是提升pcr扩增产物中与本发明所述的特异性探针杂交的负链产生效率，提升检测灵敏度；标记荧光分子是为了使结果可视化，数据化。上述修饰对所述的引物特异性并无影响，为本领域常见技术，并且为达到上述目的的方式不止本实施例所采用的这一种。其他不影响本发明所述的引物特异性的改进方式，均可以与本发明所述的特异性引物结合应用。

本发明所述的引物组合中，所述引物组1、2、3、4的摩尔比为1:1:1:2。

上述引物组1、2、3、4可分别配制成较高浓度的母液，单独包装；也可按照摩尔比混合配制成较高浓度的溶液。使用时与pcr扩增反应液混合，再加入模板dna后进行pcr扩增反应。本实施例中，配制成4倍终反应浓度的引物混合物溶液备用。

三、探针的配制

本实施例所用的特异性探针是在本发明所述的特异性探针序列(即序列9-12)的5’-末端连接上25个碱基t，并在末端进行化学修饰。

本实施例所用的探针序列如下：

用于检测vanf基因的探针1(序列9修饰后)：

nh2-poly(t)25-atacgttgccgggattcacg；

用于检测vani基因的探针2(序列10修饰后)：

nh2-poly(t)25-tcaggagacggcaaaagcca；

用于检测vanj基因的探针3(序列11修饰后)：

nh2-poly(t)25-ctccggagtggacgtactgg；

用于检测vano基因的探针4(序列12修饰后)：

nh2-poly(t)25-cgacctctcgcacggattct；

本实施例对本发明所述的特异性探针进行上述修饰，目的是使特异性探针可以通过化合键(nh2-)固定在本实施例采用的载体(醛基化基片)上；以及通过增加探针长度(poly(t)25)加大杂交反应的空间范围，抵消空间位阻对杂交效率的影响。上述修饰对本发明所述的探针特异性并无影响，为本领域常见技术，并且为达到上述目的的方式不止本实施例所采用的这一种。其他不影响本发明所述的探针特异性的改进方式，如：其他化学基团的修饰、其他类型的探针载体(硝酸纤维素膜)等，均可以与本发明所述的探针结合应用。

采用genemachine点样仪，将上述特异性探针分别溶解在50％(v/v)dmso溶液中(探针浓度为10μm)。按图1所示的探针点阵排布方式将溶解后的探针点制在醛基修饰的基片(光学级醛基基片，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：420022)上(每点用量约为0.44nl)，干燥并固定后，贴上12样品围栏(smartgrid^tm，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：430033)，制成检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的芯片，备用。

图1中所示的hybpcp3为杂交阳性对照探针，其使用目的是监测杂交反应的正常与否。其序列选自与本发明检测的目标物种(细菌)亲缘关系极远的植物(拟南芥)的基因序列(5’-gcaaccaccaccggagg)，对本发明所述的探针特异性并无影响。其他与本发明所述的探针特异性无关的序列均可采用。在杂交反应中设置对照品是本领域的常规做法，其他可起到同样目的的对照品设置方式，均可以与本发明所述的探针结合应用。

四、待测样本的检测

步骤1：用本发明所述的特异性引物组对待测样品进行pcr扩增:

分别以步骤一制备的5种质粒dna为模板，将步骤二配制的4倍终反应浓度的引物混合物与商品化的2×pcr反应液、及质粒dna模板混合后进行pcr扩增。

单个pcr反应体系为：将2×pcr反应液(天根公司产品号：kt201)10μl、4×引物混合物5μl和1μl质粒dna(10-100ng/μl)混合，补水至20μl。反应体系中，引物组1、2、3的终浓度为0.1μm，引物组4的终浓度为0.2μm。5种质粒分别进行检测，共配制5个pcr反应体系。

pcr扩增反应在dnaenginetetrad2(bio-rad)热循环仪上进行，采用以下热循环程序：94℃预变性3min→94℃变性30sec；48℃复性30sec；72℃延伸45sec，循环20次→95℃变性30sec；58℃复性30sec；72℃延伸45sec，循环20次→72℃延伸7min→冷却至16℃。

步骤2：用本发明所述的特异性探针与步骤1获得的pcr产物进行杂交：

取扩增后的pcr产物，与杂交反应液混合后进行杂交反应。

单份杂交反应体系的配制如下(根据样品数量进行体系放大)：取步骤1获得的pcr扩增产物11.5μl，与20×sspe(生工公司，产品号b548111-0200)3.75μl、4％(w/v，即4g/100ml)sds(生工公司，产品号b548118-0100)1.25μl、50×denhardt's(生工公司，产品号b548209-0050)2.5μl、100％(v/v)去离子甲酰胺(生工公司，产品号a600211-0100)5μl和杂交阳性对照(1nm)1μl混合，5种pcr扩增产物分别进行检测，共配制5个杂交反应体系。

本实施例在上述杂交反应液中使用的杂交阳性对照品，是与前述的杂交阳性对照探针hybpcp3互补的，带有荧光分子标记的寡核苷酸，序列为：tamra-cctccggtggtggttgc。其使用目的是与hybpcp3探针杂交，以监测杂交反应的正常与否。如前所述，其使用对本发明所述的探针特异性并无影响。其他与本发明所述的探针特异性无关的杂交阳性对照品均可采用。在杂交反应中设置对照品是本领域的常规做法，其他可起到同样目的的对照品设置方式，均可以与本发明所述的探针结合应用。

将制备好的四种糖肽类药物耐药基因检测芯片和盖片(smartcover^tm，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：430044)放置于杂交盒内。针对每一份待测样品，取20μl已配制好的杂交反应体系，加样后封闭好杂交盒，置于32℃杂交2小时。杂交结束后，取出芯片，置于洗液(2×ssc和0.2％sds)中，室温摇洗5分钟；之后将芯片用去离子水漂洗5分钟后，离心甩干。

步骤3：检测结果采集及分析

芯片上的荧光信号采用genepix4200al激光共聚焦扫描仪及其配套软件genepixpro.6.0(axoninc.)扫描采集。扫描参数如下：激发光波长：532nm；laserpower：33％；pmt：400。

用genepixpro6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号，计算每一个探针信号点的信噪比(signalnoiseratio，snr＝(信号值-背景值)/背景值)，从而确定样品中糖肽类药物耐药基因类型，提示耐药性。当信噪比大于等于3时，判定该探针所对应的基因检测结果为阳性，如所有特异性探针信噪比均小于3，则判定该待测样品中不包含待测的四种糖肽类药物耐药基因。

本实施例中，5种待测样品的检测结果如图2所示。

结果显示，针对待测样本1，即包含耐药基因vanf的质粒，仅特异性探针1(序列9)杂交结果为阳性，显示样品中包含vanf耐药基因；针对待测样本2，即包含耐药基因vani的质粒，仅特异性探针2(序列10)杂交结果为阳性，显示样品中包含vani耐药基因；针对待测样本3，即包含耐药基因vanj的质粒，仅特异性探针3(序列11)杂交结果为阳性，显示样品中包含vanj耐药基因；针对待测样本4，即包含耐药基因vano的质粒，仅特异性探针4(序列12)杂交结果为阳性，显示样品中包含vano耐药基因；针对待测样本5，即阴性对照质粒puc18，无特异性探针杂交结果为阳性，显示本发明所述的特异性引物和探针组合对vanf、vani、vanj和vano基因有极强的检测特异性。

实施例3、用本发明所述的特异性引物探针组合检测革兰氏阳性细菌菌株

本实施例对已收集的糖肽类药物耐药革兰氏阳性细菌菌株，进行了vanf、vani、vanj和vano耐药基因的检测，以说明本发明提供的特异性引物探针组合可用于检测糖肽类药物耐药革兰氏阳性细菌菌株中上述四种耐药基因的检测。

具体如下：

一、待测样品

由于本发明所涉及的四种糖肽类药物耐药基因vanf、vani、vanj和vano在革兰氏阳性细菌中的分布，相较于糖肽类药物耐药基因vana、vanb在肠球菌中的分布而言，较为少见，其中vanj和vano基因分离率更低。通过收集分离菌株的方式收集包含上述四种糖肽类药物耐药基因的菌株，需要耗费大量的时间和材料成本，并且仍有可能是可遇而不可求。而通过向已报道相关糖肽类药物耐药基因的实验室索取非商业用途的菌株或克隆，也有可能带来耐药基因的扩散问题，导致相关药物治疗无效情况的扩散，也很难成功。有鉴于此，本实施例用本发明所述的特异性引物探针组合，分别对已收集的部分万古霉素耐药革兰氏阳性细菌菌株，以及万古霉素耐药和敏感肠球菌菌株进行了检测，说明本发明所述的特异性引物探针组合，可用于待测样品中相关耐药基因的检测。

经测序确认，样品gp381包含vanf基因，样品gp168包含vani基因，样品gp118、gp073和ecc008、ecc014不包含任何待检测的四种糖肽类药物耐药基因。

对上述细菌菌株，采用qiagene公司dneasyblood&tissuekit(产品号：69506)提取细菌全基因组核酸。

二、引物组合的配制

本实施例使用的引物组合配制方法和步骤同实施例2。

三、探针的配制

本实施例使用的探针组合配制方法和步骤同实施例2。

四、待测样本的检测

步骤1：用本发明所述的特异性引物组对待测样品进行pcr扩增

方法及步骤同实施例2。仅将pcr扩增体系中的模板由质粒dna替换为从上述待测菌株中提取的细菌全基因组核酸(浓度为200ng/μl左右)。

步骤2：用本发明所述的特异性探针与步骤1获得的pcr产物进行杂交

方法及步骤同实施例2。

步骤3：检测结果采集及分析

方法及步骤同实施例2。

待检样品经本发明所述的特异性引物组合扩增，并与本发明所述的特异性探针杂交后，经过信号提取，上述待检样品的信噪比计算结果如下表2所示。

表2

针对样品gp381，仅vanf特异性探针(序列9)杂交结果为阳性，显示样品gp381中包含vanf耐药基因；针对样品gp168，仅vani特异性探针(序列10)杂交结果为阳性，显示样品gp168中包含vani耐药基因；针对样品gp118、gp073和ecc008、ecc014，无特异性探针杂交结果为阳性，显示样品gp118、gp073和ecc008、ecc014中不包含任何待测的四种糖肽类药物耐药基因。

所有待测样品的检测结果与测序结果完全一致，且特异性探针与且仅与包含探针所对应耐药基因的样品产生阳性信号，而与其他基因pcr扩增产物之间均没有非特异性杂交，显示出极高的探针特异性，说明本发明提供的特异性引物探针组合适用于分离菌株中四种糖肽类药物耐药基因的检测。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>检测革兰氏阳性细菌中四种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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