一株微杆菌W-Y13及其应用的制作方法

本发明涉及微生物采油
技术领域：
，具体涉及一株微杆菌w-y13及其应用。
背景技术：
：石油污染分布广泛，涉及采油、炼油、化工、机械等各种工业，以及石油泄漏等各种污染环境。石油烃组分复杂多样，疏水性强而难以被普通微生物所接触、所降解、所利用。微生物采油技术就是通过向地层中注入营养或微生物，利用油藏中微生物的生长代谢活动，提高原油产量和采收率。传统的石油功能菌株多分离水体、土壤中。现有的研究表明，微生物除分别在水、土中外，在石油油相中也有广泛的分布，因此从石油油相中分离相关的功能菌株在微生物采油技术中具有重要意义。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一株微杆菌microbacteriumsp.w-y13。本发明提供的微杆菌microbacteriumsp.w-y13的保藏编号为cgmccno.17151，其分类命名为微杆菌microbacteriumsp.，已于2019年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。本发明的另一个目的是提供微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。本发明提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油采油中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油采油的产品中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在微生物采油中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备微生物采油的产品中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油乳化中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油乳化的产品中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油降解中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油降解的产品中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油污染治理中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油污染治理的产品中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油污染修复中的应用。本发明还提供了微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油污染修复的产品中的应用。本发明还有一个目的是提供一种产品。本发明提供的产品的活性成分为微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；所述产品具有如下1)-6)中任一种功能：1)石油采油；2)微生物采油；3)石油乳化；4)石油降解；5)石油污染治理；6)石油污染修复。上述应用或产品中，所述石油可为原油；进一步的，所述原油可为稠油；更进一步的，所述稠油可为特稠油。本发明还有一个目的是提供一种微生物采油的方法。本发明提供的微生物采油的方法包括如下步骤：在采油的过程中，加入微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂。本发明的最后一个目的是提供一种石油污染治理和/或修复的方法。本发明提供的石油污染治理和/或修复的方法包括如下步骤：用微杆菌microbacteriumsp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂处理石油污染物。上述应用或产品或方法中，所述微杆菌microbacteriumsp.为微杆菌microbacteriumsp.w-y13cgmccno.17151。上述应用或产品或方法中，所述菌剂的制备方法如下：将微杆菌microbacteriumsp.w-y13cgmccno.17151接种至lb培养基(lb培养基溶剂为水，溶质及其浓度分别为：10g/lnacl、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉，ph7-8)中培养，得到所述菌剂。所述菌剂中的菌浓度不低于108cfu/ml。本发明提供了一种微生物采油菌w-y13，其分类命名为微杆菌microbacteriumsp.，该菌株已于2019年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17151。通过实验证明：本发明的微生物采油菌w-y13能够乳化原油，不仅可用于微生物采油，提高采油率，还可用于石油污染的治理和修复，具有很好的应用前景。附图说明图1为w-y13的16srdna基因系统发育树。图2为w-y13的gyrb基因系统发育树。图3为w-y13乳化特稠油。左为w-y13，右为对照。保藏说明拉丁名：微杆菌microbacteriumsp.菌株编号：w-y13保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2019年1月10日保藏中心登记入册编号：cgmccno.17151具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的lb培养基配方如下：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：10g/lnacl、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉，ph7-8。下述实施例中的cgmccno.14243菌株的保藏编号为cgmccno.14243，分类命名为microbacteriumsaccharophilum，已于2017年06月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。cgmccno.14243菌株记载于发明名称为“一种油藏本源微杆菌及其在石油开采中的应用”、申请号为201710759313.9、公布号为cn107523517a的专利文献中。实施例1、w-y13菌株的分离、鉴定及保藏一、w-y13菌株的分离2017年9月，从新疆克拉玛依的胜利油田的油井采出液中获得油相石油，发明人从中分离得到一株菌，将其命名为菌株w-y13。二、w-y13菌株的鉴定1、w-y13菌株的形态鉴定w-y13菌株的形态特征：在lb固体平板上为湿润凸起黄色菌落，菌体为短杆状不产芽孢。2、w-y13菌株的生理生化鉴定w-y13菌株的生理生化特征：能够利用葡萄糖和蔗糖作为碳源，适合温度30-35℃。3、w-y13菌株的分子鉴定将活化的w-y13菌株接种在lb培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h。取1ml新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于2ml离心管中，采用dna提取试剂盒提取dna。电泳检测后，分别采用16srdna基因通用引物8f/1492r和gyrb基因通用引物up1f/up2r进行pcr扩增。pcr产物电泳检测后，测定16srdna基因序列和gyrb基因序列，16srdna基因具体序列如序列表中序列1所示，gyrb基因具体序列如序列表中序列2所示。16srdna基因序列经过比对后属于microbacterium菌，基于16srdna基因使用软件mega构建的系统发育树如图1所示。基于gyrb基因使用软件mega构建的系统发育树如图2所示。综合以上鉴定结果表明，菌株w-y13是一种新发现的microbacterium菌。三、w-y13菌株的保藏w-y13菌株的分类命名为微杆菌microbacteriumsp.，该菌株已于2019年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.17151。实施例2、w-y13菌株对特稠油乳化本实施例中的石油于2017年9月采集自新疆克拉玛的胜利油田，30℃的石油粘度为35076mpa.s，属特稠油。1、将活化后的w-y13接种至lb培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到w-y13菌液(菌浓度≥108cfu/ml)。2、试验组：将5体积份菌液接种至95体积份石油-无机盐培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为1g/l石油、5g/lnacl、1g/lnh4h2po4、1g/l(nh4)2so4、1g/lk2hpo4、3g/lkno3，ph7-8)中，30℃、150rpm振荡培养15d。对照组1：将100体积份石油-无机盐培养基，30℃、150rpm振荡培养15d。对照组2：将5体积份的cgmccno.14243菌液接种在95体积份石油-无机盐培养基，30℃、150rpm振荡培养15d。其中，cgmccno.14243菌液为将活化后的cgmccno.14243接种至lb培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h后得到的菌液(菌浓度≥108cfu/ml)。3、完成步骤2后，照片结果见图3。图3中，左1为试验组，左2为对照组1、左3为对照组2。菌株w-y13在30℃下对特稠油出现明显的乳化作用；而cgmccno.14243没有乳化效果，推测cgmccno.14243只对稀油(粘度小于50mpa.s)有乳化效果。4、按照文献“原油降解菌的分离及其降解性能”中的方法测定完成步骤2的体系中的石油残余量，计算石油降解率。石油降解率＝(石油加入量-石油残余量)/石油加入量。计算结果表明：石油降解率为41.8％。实施例3、w-y13菌株在微生物采油技术中的应用本实施例中的石油于2017年9月采集自新疆克拉玛的胜利油田，30℃的石油粘度为35076mpa.s，属特稠油。本实施例通过室内物模驱油实验评价微生物菌种的驱油效果。具体实验方法如下：1、采用高压模型管(规格购自海安石油科研仪器有限公司)内填装不同目数的石英砂制作为填砂模型管。采用渗透率测量装置测量模型管渗透率，选择符合的模型管。抽真空饱和地层水，计算孔隙度；最终制备的用于后续步骤的模型管的参数见表1。表1、模型管填砂参数2、从模型管入口持续注入石油，直至模型管出口检测到石油流出，测量原始含油饱和度；并在油藏温度(30℃)下老化3天。3、用注入水进行驱油，至出口产出液达到极限含水率(98％)停止水驱，计算采收率(即为水驱采收率)。4、按照1个模型管孔隙体积容积的注入量注入含菌水(完成注入后，计算采收率，即为注微生物过程采收率)，在油藏温度(30℃)下培养30天。含菌水的制备方法如下：将活化的w-y13接种在lb培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到w-y13菌液(菌浓度≥108cfu/ml)。在注入水中加入w-y13菌液、nh4h2po4、(nh4)2so4、k2hpo4、kno3、蛋白胨和酵母粉，使其在含菌水的中浓度分别为5％(体积分数)w-y13菌液、1g/lnh4h2po4、1g/l(nh4)2so4、1g/lk2hpo4、3g/lkno3、2g/l蛋白胨和1g/l酵母粉。5、再用注入水进行驱油，至出口产出液达到极限含水率(98％)停止水驱，计算采收率(即为微生物作用后续水驱采收率)。对水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率进行了对比，结果见表2。室内物模驱油表明，使用w-y13菌株可以提高采收率6.11％。表2、采收率物模阶段采收率(％)提高采收率(％)水驱36.51/注微生物过程38.642.13微生物作用后续水驱42.626.11序列表<110>北京润世能源技术有限公司<120>一株微杆菌w-y13及其应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1379<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgcagtcgaacggtgaacacggagcttgctctgtgggatcagtggcgaacgggtgagtaa60cacgtgagcaacctgcccctgactctgggataagcgctggaaacggcgtctaatactgga120tatgtgacgtgatcgcatggtctgcgtctggaaagaatttcggttggggatgggctcgcg180gcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgtcgacgggtagccggcctga240gagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagt300ggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcaacgccgcgtgagggatgacggc360cttcgggttgtaaacctcttttagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaaaa420agcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttatccgg480aattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgctgtgaaatccggaggc540tcaacctccggcctgcagtgggtacgggcagactagagtgcggtaggggagattggaatt600cctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcagatct660ctgggccgtaactgacgctgaggagcgaaagggtggggagcaaacaggcttagataccct720ggtagtccaccccgtaaacgttgggaactagttgtggggtccattccacggattccgtga780cgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaag840gaattgacggggacccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaag900aaccttaccaaggcttgacatatacgagaacgggccagaaatggtcaactctttggacac960tcgtaaacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc1020cgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtaatggtgggaactcatgggat1080actgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgt1140cttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaaagggctgcaataccgcgaggtggag1200cgaatcccaaaaagccggtcccagttcggattgaggtctgcaactcgacctcatgaagtc1260ggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggtcttgtac1320acaccgcccgtcaagtcatgaaagtcggtaacacctgaagccggtggcctaacccttgt1379<210>2<211>888<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acaaggggctgcgcatcgagctgaaggacgagcgggagtcctcggcctacgaggtggagg60aggacggcgcgaccgtcacccgccagccgagcgacgtgttcttctacgagcgcggcctcg120tcgactacgtcgagtacctcaacaaggtccgccatgccgaggtcgtgaacgacgagatca180tcgcgttcgagtccgaggacaccgagcggaagatctcgctcgaggtcgcgatgcagtgga240ccacctcgtacaccgagaacgtgttcacctacgccaacacgatcaacacgcacgagggag300gcacccacgaggagggcttccgcgcggcgctgaccactctcgtgaacaagtacgcccgcg360cgaacaacctgctcaaggagaaggacgacaacctctccggcgacgacgtgcgcgagggac420tgacggccgtcatctcgatcaagctcggcgagccccagttcgaggggcagaccaagacga480agctcggcaacaccgaggcgaaggcgttcgtgcagaaggtcgtcggcgatcagctcggcg540actggttcgatcgcaacccgaaccaggcgaagaacatcatccgcaaggcgatcgacgcgg600ccaccgcccgtctcgccgcgcgcaaggcccgggagaccgcgcggcgcaagagcgtcttcg660agtcggcggccatgccggacaagctcaaggactgcacgagcaaggatccgtcgatcagcg720agatcttcctggtggagggtgactccgccggcggttcggccgtgcaggggcgcgacccgc780acacccaggcgatcctcgcgctgcgcggcaagatcctcaacgtggagcgtgcacgtctcg840acaaggctttgggtaacaaggaagtccaggcgatgatccaggccttcg888当前第1页12