一株具有益生活性的丁酸梭菌CG3及其培养方法与应用与流程

本发明属于丁酸梭菌及其培养，尤其涉及一株具有益生活性的丁酸梭菌cg3及其培养方法与应用。

背景技术：

浅色黄姑鱼(nibeacoibor)，俗名白奈，金丝鲵，隶属于石首鱼科，黄姑鱼属，是我国重要的海水养殖经济鱼类，其鱼鳔制品“鱼胶”，为市场上高级滋补品，备受消费者青睐。但浅色黄姑鱼的高密度养殖受细菌性病害的危害极大，导致成鱼养殖成活率低，直接影响了浅色黄姑鱼养殖业的发展。抗生素及化学药物在水产动物病害防治中曾发挥重要作用，但因其引起的细菌耐药性，药物残留等负面作用也日益明显，同时由于人们对水产品质量安全的高度关注，因此生态养殖日益受到重视。目前，益生菌在促进水产动物生长，改善养殖环境，增强抗病力方面已取得明显效果，但在水产上使用的益生菌仅有乳酸杆菌、链球菌、芽胞杆菌、双歧杆菌以及酵母菌等。因此，开发新的益生菌株对水产养殖的可持续发展意义深远。

产丁酸菌作为新兴益生菌，成为近年来肠道益生菌研究的一个前沿和热点。但已成功分离到的产丁酸菌株数量稀少，应用于水产养殖中仅丁酸梭菌一种，对于此类菌的系统研究知之甚少，而且也不是很透彻，未来这方面的基础研究工作还需要更多的关注。

肠道产丁酸菌的研究进展：许多研究参考barcenilla等(2000)报道的m2gsc培养基分离方法，以体外培养丁酸产量大于2mm为阈值判断是否为产丁酸菌。但该培养基营养较丰富，满足肠道内绝大部分微生物的生长，导致分离工作量大，也存在一定的盲目性，不便短时间做出判定，限制了对该类群的深入认识。barcenilla等(2000)利用厌氧滚管技术从3个健康人(婴儿，成年素食者和成年杂食者)的新鲜粪样中分离到313株产丁酸菌，其中从婴儿粪样中分离到的产丁酸菌产丁酸浓度最高，产丁酸菌种类最多，素食者次之，杂食者粪样中产丁酸菌的种类要明显少于前两者。研究表明，肠道丁酸的合成除了取决于肠道中产丁酸菌的种类和数量，还与进入后端肠道的碳水化合物数量和种类有关。这也是本发明关注的重点，期望用寡糖和糖醇来体外富集产丁酸菌，从而分离获得有应用潜力的益生菌株。

益生菌的安全性问题一直备受关注，国内外研究者提出多种安全性评价指标和方法，诸如溶血性、有害代谢产物、毒力因子检测、抗生素抗性、对胃肠黏膜蛋白的分解能力等体外评价和动物模型评价(冯媛媛，2017)。菌株是否有溶血性是筛选益生菌的先决条件，目前溶血性的评价方法主要是通过血平板培养进行。另一方面，细菌耐药性的广泛传播和多重耐药菌株的出现已成为严重的公共卫生问题，如果益生菌携带的抗性基因在养殖环境和食品中发生转移，将严重影响人类健康和恶化养殖环境。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株具有益生活性的丁酸梭菌cg3及其培养方法与应用，以解决现有技术存在的问题。

通过查阅文献确定10种功能性寡糖和糖醇，分别与动物的肠道内容物进行体外厌氧发酵实验，丁酸产量较高的发酵液用来稀释涂平板分离单菌。各菌株体外培养24h后丁酸产量大于2mm即为产丁酸菌。在浅色黄姑鱼养殖试验中，饲料中添加丁酸梭菌cg3可以提高浅色黄姑鱼的生长性能及免疫反应，改善宿主健康及肠道微生态。一株具有益生活性的丁酸梭菌cg3(clostridiumbutyricumcg3)，已于2019年1月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection，cctcc)，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏编号为cctccno:m2019071。

进一步的，所述具有益生活性的丁酸梭菌cg3对抗生素敏感。

进一步的，所述抗生素包括哌拉西林、羧苄西林、氨苄西林、苯唑西林、青霉素、头孢呋辛、头孢拉定、头孢唑啉、头孢氨苄、卡那霉素、庆大霉素、头孢哌酮、头孢曲松、红霉素、米诺环素、多西环素、新霉素。

上述具有益生活性的丁酸梭菌cg3的培养方法，采用的培养基为pyag培养基，主要包括蛋白胨5g，胰化酪蛋白胨5g，酵母提取物10g，na2co34g，氯化血红素5mg，k2hpo40.4g，kh2po40.04g，nahco30.08g，nacl0.04g，cacl28mg，mgso4·7h2o1.9mg，vitamink11mg，乙酸钠4.49g，葡萄糖5g，调ph至6.8，加双蒸水定容至1l。

上述具有益生活性的丁酸梭菌cg3的应用，作为饲料添加剂。

进一步的，用于浅色黄姑鱼的饲料中，所述饲料包括10⁷cfu/g丁酸梭菌cg3或者10⁷cfu/g丁酸梭菌cg3+0.5％菊粉+0.5％低聚半乳糖。

与现有技术相比，本发明具有益生活性的丁酸梭菌cg3及其合生元显著提高了鱼的生长性能、提高肠道消化酶活，改变肠道菌群的组成和多样性指数，还富集了许多scfa产生菌，以及增加鱼肠道scfas含量。此外，还可以通过调节血清补体和细胞因子水平、溶菌酶活性和肠道抗氧化能力来激活浅色黄姑鱼免疫系统。而且无溶血性，对大部分抗生素都敏感，没有耐药性，安全性较高；可以作为浅色黄姑鱼的饲料添加剂，起到促进生长和防治疾病的作用。

附图说明

图1是两种黄姑鱼肠道内容物发酵10种寡糖或糖醇产丁酸情况，初始样丁酸含量及低聚果糖、抗性淀粉发酵产丁酸含量均低于检出限；

图2是两种黄姑鱼肠道内容物发酵5种寡糖或糖醇产丁酸情况，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

图3是丁酸梭菌cg3的菌落形态(a)、扫描电镜图(b)与淀粉酶检测结果(c)；

图4是丁酸梭菌cg3的生长曲线及产scfa规律；

图5是丁酸梭菌cg3对浅色黄姑鱼肠道菌群β-多样性的影响，非度量多维尺度(nmds)图是基于3种不同饲料(分别为cb、cbig和control)喂养的肠道菌群的weighted-unifrac距离绘制的，每个点代表一个样本，颜色代表不同的处理组；

图6是丁酸梭菌cg3对浅色黄姑鱼肠道优势菌(门水平)丰度的影响，小写字母标注无相同者表示相互间差异显著(p<0.05)；

图7是三种不同的饲料投喂下浅色黄姑鱼的肠道差异菌分析，lefse分析中当kruskal-wallis和wilcoxon检验的alpha值小于0.05，对数lda评分达到3.5时，可认为处理组间细菌类群的相对丰度有显著变化；

图8是三种不同的饲料投喂下浅色黄姑鱼的肠道差异通路分析；

图9是丁酸梭菌cg3对浅色黄姑鱼肠道短链脂肪酸含量的影响：(a)乙酸，(b)丙酸，(c)丁酸，(d)scfas，数据为平均值±标准误(n＝3)；小写字母标注无相同者表示相互间差异显著(p<0.05)；

图10是丁酸梭菌cg3对浅色黄姑鱼消化酶活、免疫和抗氧化指标，小写字母标注无相同者表示相互间差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

1.厌氧pbs缓冲液、液体培养基、固体培养基配制

pbs缓冲液：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.42g，kh2po40.24g或nahpo4·12h2o3.58g，调ph至7.4，加双蒸水定容至1l。

py培养基：蛋白胨5g，胰化酪蛋白胨5g，酵母提取物10g，na2co34g，氯化血红素5mg，k2hpo40.4g，kh2po40.04g，nahco30.08g，nacl0.04g，cacl28mg，mgso4·7h2o1.9mg，vitamink11mg，调ph至6.8，加双蒸水定容至1l。pya培养基加4.49g乙酸钠；pyag培养基加4.49g乙酸钠和5g葡萄糖；固体培养基则在上述基础上加15g的琼脂；寡糖和糖醇的储备液浓度为0.5g/ml。

厌氧培养基的配制：准确称取配制培养基(包括py、pya、pyag培养基、寡糖或糖醇储备液)的各成分，按照一定顺序加水溶解于细口烧瓶中，一边加热磁力搅拌一边通入高纯氮气，按1:100的比例加入0.1％刃天青溶液，当溶液由蓝色变为粉红色时，向通气的溶液中加入l-盐酸半胱氨酸一水物0.5g/l和九水硫酸钠0.048g/l溶解后，迅速将溶液分装到充气中的血清瓶，用丁基橡胶塞密封，打盖器加盖铝盖，高压蒸汽灭菌。

2.寡糖或糖醇与肠道内容物的体外厌氧发酵

先用吸水纸将浅色黄姑鱼全身擦干，然后用75％的酒精喷淋全身，将其转移至超净工作台解剖，取其肠道用灭菌镊子挤出内容物至已称重的离心管中，内容物称重后迅速转移至厌氧操作台。用灭菌去氧pbs缓冲液按照质量体积比1:9进行稀释匀浆，然后分装到厌氧血清瓶，再加入寡糖或糖醇储备液及pbs缓冲液至肠液终浓度为1％，寡糖或糖醇终浓度为0.5％，每个处理做三个重复，28℃培养36h后取2ml发酵液测scfa浓度。结果发现两种黄姑鱼肠道内容物在同一益生元发酵下产丁酸情况不一样，如图1所示。对于浅色黄姑鱼，发酵液中丁酸产量最高的益生元为菊粉，接着是d-山梨醇、低聚半乳糖gos；对于双棘黄姑鱼，发酵液中丁酸产量前三的益生元分别为低聚木糖xos、gos和抗性淀粉rs。

因此选取初筛效果较好的益生元(每种鱼各三种)进行复筛，且提高接种物浓度至10％，操作同上，用灭菌去氧pbs缓冲液28℃培养24h后取2ml发酵液测scfa浓度。结果发现测试的益生元均显著促进两种黄姑鱼肠道内容物体外发酵产乙酸、丙酸的能力，从而导致总scfas也显著上升，如图2。对于浅色黄姑鱼，菊粉和gos对丁酸产生有显著促进作用；对于双棘黄姑鱼，xos、gos和rs均可显著提高丁酸产量。

剩余发酵液则用灭菌去氧pbs缓冲液按照质量体积比10^-4-10^-7进行稀释涂平板(pya+寡糖或糖醇培养基)，28℃培养48h后挑取形态各异的单菌落进行液体培养，28℃培养24h后进行色谱检测scfa产量，其中编号为cg3的菌株丁酸产量为4.69±0.08mm，而丁酸产量>2mm的菌株可认为是产丁酸菌。利用gos的富集作用，从而从浅色黄姑鱼肠道菌群发酵液中分离cg3产丁酸菌。将cg3菌株均接种到两种培养基中，一种是pyag，另一种则为py+0.5％gos。cg3在pyag培养基上丁酸产量为26.50±0.85mm，在py+0.5％gos培养基上丁酸产量为18.90±2.56mm。一方面可能是因为葡萄糖是容易被细菌利用的碳源，所以在24h内产丁酸较多；另一方面可能是因为部分产丁酸菌可以通过丁酰coa：乙酰coa转移酶途径产生丁酸，即需要消耗乙酸来合成丁酸(barcenillaetal.,2000)，而pyag里添加了乙酸能加速丁酸的生成。

3.菌株鉴定与特性研究

利用通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-tacggttaccttgttacgactt-3')得到菌株的16srdna序列，在ncbi网站上blast比对发现，其中一株与clostridiumbutyricumdsm10702同源性最高(99.93％)，确定为clostridiumbutyricumcg3(以下简称cg3)。

cg3在pyag上生长良好，表面菌落圆或稍不规则，呈白色，直径1-4mm，中间凸起颜色稍深，表面湿润有光泽，如图3a。从电镜图可以看出cg3直径为0.6～0.8μm，长度为3.0～7.0μm，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，周身鞭毛菌株形态见图3b(扫描电镜图)。

cg3的生长曲线及scfa产生规律见图4。cg3所用培养基为py+ig(即菊粉和gos)，菌株cg3在24h时后od值变动幅度不大，说明细菌生长缓慢已进入稳定期，但丙酸和丁酸仍在不断积累。

4.酶活性与溶血性检测

检测了淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、卵黄卵磷脂酶、脂酶和接触酶活性。其中丁酸梭菌cg3检测到淀粉酶活性(图3c)，其他酶活反应均为阴性。溶血性检测cg3为无溶血性。

5.产丁酸菌体外代谢特性

丁酸梭菌cg3的生化特性较为活泼，能够利用多种单糖、寡糖、多糖和糖醇；但不能利用l-山梨糖、d-山梨醇和木糖醇；对低聚木糖则为微弱利用，如表1所示。

表1丁酸梭菌cg3的体外代谢特性

注：+，为利用；-，不利用；-+，微弱利用。

6.抗生素抗性

按照抗菌药物药敏纸片配套的《药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准》，将药敏实验结果分成以下三级：耐药(resistant)、中介(intermediate)和敏感(susceptible)。如表2所示，cg3对绝大多数的抗生素都敏感，没有耐药性，安全性较高。

表2丁酸梭菌cg3的抗生素耐药情况

注：r，耐药(resistant)；i，中介(intermediate)；s，敏感(susceptible)。

7.产丁酸途径关键酶基因

产丁酸菌可通过丙酮酸代谢生成丁酰coa，最终经两条代谢途径产生丁酸：丁酰coa:乙酰coa转移酶途径和丁酸激酶途径。因此，检测了这两条丁酸产生途径的关键酶，cg3的液体培养液中可检测到丁酰coa：乙酰coa转移酶和丁酸激酶基因。

8.饲养实验

养殖实验地点为汕头大学南澳临海试验站，实验幼鱼购自饶平县。在海上大网箱中(2.0×2.0×2.0m)暂养2周，期间投喂商业基础饲料(粗蛋白45.0％，粗脂肪7％)。养殖实验选用体质健康，规格一致(初始体重为13.68±0.07)的浅色黄姑鱼幼鱼，随机分成3个处理组，分别喂养以下三种饲料：cb(10⁷cfu/g丁酸梭菌cg3)、cbig(10⁷cfu/g丁酸梭菌cg3+0.5％菊粉+0.5％低聚半乳糖)及基础饲料组control。每个处理组3个重复，每个重复一个网箱(1.0×1.0×1.5m)，每个网箱20尾鱼。养殖实验期间采取饱食投喂，每天早6:00和晚18:00投喂两次，称重并记录投喂饲料重量。试验期间，海水水温为20-30℃，盐度为36‰左右，ph为8.7左右，溶解氧大于5.5mg/l。8周养殖试验结束后，分别测量试验鱼的体重、体长，随后采集血样、肠道组织及无菌技术收集肠道内容物，尽快完成肠道微生物、短链脂肪酸、消化酶活及免疫酶活，血清免疫酶活的测定。

8.1存活率与生长性能

8周养殖实验的生长数据见表3。从表中可以看出，相对于对照组，cb和cbig组可以显著提高浅色黄姑鱼的末重、增重率和特定生长率。

表3丁酸梭菌cg3对浅色黄姑鱼生长指标的影响

注：数据为平均值±标准误(n＝3)；*表示相互间差异显著(p<0.05)。

8.2肠道菌群分析

12个肠道内容物样品的16srrna基因v4可变区测序共得到884,338reads，otu数从762个至1,634个。通过nmds分析发现cb、cbig组距离较近，与对照组分别聚成两簇，如图5。

α-多样性指数计算结果如表4所示，cb组的肠道菌群多样性最高。

表4丁酸梭菌cg3对肠道菌群α-多样性指数的影响

注：数据为平均值±标准误(n＝3)；*表示相互间差异显著(p<0.05)。

浅色黄姑鱼肠道中门水平上的优势菌，为变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)，如图6。与对照组相比，cb和cbig均显著降低变形菌门的相对丰度，而厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度则有升高的趋势。在属水平上，优势菌为不动杆菌属acinetobacter(control:9.47％；cb:4.65％；cbig:3.23％)、unidentifiedchloroplast(control:6.37％；cb:4.80％；cbig:8.90％)、葡萄球菌属staphylococcuscontrol:5.73％；cb:1.90％；cbig:1.62％)、拟杆菌属bacteroides(control:4.27％；cb:7.30％；cbig:4.66％)、螺杆菌属helicobacter(cbig:4.05％)、普拉梭菌属faecalibacterium(control:0.55％；cb:1.85％；cbig:1.86％)。

通过lefse分析可获得处理组间的差异物种，如图7。对于control、cb和cbig三组的比较，control组显著富集变形菌门，cb组显著富集ruminococcaceaeucg_014(厚壁菌门)、bifidobacterium(放线菌门)和rheinheimera(变形菌门)，而cbig则显著富集clostridiumsensustrict1、lactobacillussalivarius(厚壁菌门)和akkermansiamuciniphila(疣微菌门verrucomicrobia)等。

利用tax4fun分析预测浅色黄姑鱼肠道菌群功能，获得kegg3个层级和ko的相对丰度信息，通过方差分析筛选出具有显著差异的通路。cbig组可以显著降低上皮细胞的细菌入侵通路(bacterialinvasionofepithelialcells)的相对丰度，还可以显著降低霍乱弧菌感染通路(vibriocholerainfection)的相对丰度如图8。

cb和cbig组肠道scfa的含量均比对照组的高，尤其是cb组如图9，cb、cbig组显著提高丙酸的含量。

与对照组相比，cb和cbig组的c3、c4、igm、il-1β、il-6、tnf-α、il-10、tgf-β、lzm和t-sod含量均显著增加，mda含量均显著下降，如图10。此外，cb组还显著增加t-aoc、cat和蛋白酶trypsin含量，提高蛋白酶活性。淀粉酶和脂肪酶活性在cb和cbig组均检测不到显著性变化。

总而言之，丁酸梭菌cg3及其合生元显著提高了鱼的生长性能、提高肠道消化酶活，改变肠道菌群的组成和多样性指数，还富集了许多scfa产生菌，以及增加鱼肠道scfas含量。此外，还可以通过调节血清补体和细胞因子水平、溶菌酶活性和肠道抗氧化能力来激活浅色黄姑鱼免疫系统。这些结果表明，丁酸梭菌cg3及其合生元可以作为浅色黄姑鱼的饲料添加剂，起到促进生长和防治疾病的作用。