一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明涉及一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用，属于动物遗传育种技术领域。

背景技术：

鸡的羽色十分丰富，是鸡的重要品种特征之一，也是鸡育种工作中一项重要选择指标。鸡的浅芦花羽也叫哥伦比亚羽，具体表现为：羽毛外观主体基本为白羽，颈部、翼部和尾部的羽毛末端有黑色横斑呈横斑浅芦花状，其为性连锁哥伦比亚羽。伴性哥伦比亚羽由于其特点鲜明，伴性遗传，获得了更多的关注和研究。

哥伦比亚羽作为一种性状，表现在豫粉1号h系中，国外具有哥伦比亚色洛克鸡。2004年开始，连续2年利用引进的巴布考克b-380祖代c系公鸡的混合精液，与固始鸡原始群体中哥伦比亚母鸡进行级进杂交，从中选出哥伦比亚羽的公母鸡，然后进行横交固定，闭锁繁育，获得豫粉1号鸡。自2008年开始又分快羽、慢羽进行家系选育，其中h系为快羽系、n系为慢羽系。鸡的羽色为质量性状，受众多基因控制，其遗传也是一个复杂的过程，目前没有较好的检测鸡哥伦比亚羽基因型的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物，能够较好的检测鸡的哥伦比亚羽基因型。

本发明还提供了鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，能够用于检测鸡的哥伦比亚羽基因型。

本发明还提供了鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，能够检测出鸡的哥伦比亚羽基因型。

本发明还提供了上述鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的应用，为鸡哥伦比亚羽品种的育种提供了一种新方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物，所述检测引物的pcr扩增序列覆盖如seqidno.1所示序列的第33-95位。

如seqidno.1所示序列为rai14基因上游区域序列，rai14基因全称为维甲酸诱导蛋白14基因，是首先在肝脏中鉴定的肌动蛋白结合蛋白。在人体内，rai14基因在外质特化中发挥肌动蛋白调节作用，对于精子极性的建立和正常精子细胞的粘附极其重要，也可能促进血睾屏障的sertoli细胞紧密连接的完整性；在鸡体内，rai14基因位于z染色体上，有2个转录物(剪接变体)。本发明中发现rai14基因上游区域序列第33-95位63bp碱基序列的插入与鸡哥伦比亚羽性状具有密切的联系，属于鸡伴性哥伦比亚羽基因，因此本发明中利用rai14基因上游区域的63bp碱基序列插入的特点，建立了针对该插入的pcr基因分型方法，进而可以对哥伦比亚羽鸡基因进行分型。

优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′(如seqidno.3所示)；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′(如seqidno.4所示)。

上述引物扩增片段的大小分别为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为z^h型；194bp为63bp碱基序列缺失，为z^h型。

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含检测引物，所述检测引物的pcr扩增序列覆盖如seqidno.1所示序列的第33-95位。

本发明中的检测试剂盒包含鸡哥伦比亚羽基因型检测引物，能够对哥伦比亚羽鸡基因进行分型。

优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′。

上述引物扩增片段的大小分别为257bp或者194bp(如seqidno.2所示)，257bp为63bp碱基序列插入，为z^h型；194bp为63bp碱基序列缺失，为z^h型。

优选的，上述试剂盒中还包括2×taqpcrmastermix。提供pcr扩增反应所需物质。

一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，包括以下步骤：1)以待测鸡的基因组dna为模板，用检测引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述检测引物的pcr扩增序列覆盖如seqidno.1所示序列的第33-95位；2)对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果鉴定鸡哥伦比亚羽的基因型。

本发明中的检测方法能够检测出如seqidno.1所示序列的第33-95位为插入/缺失，进而检测出鸡哥伦比亚羽的基因型。该方法具有如下优点：操作简单、检测快速、结果准确，有利于在育种实践中更有效快速地对哥伦比亚羽性状进行选择，加快育种进展，节约育种成本，为哥伦比亚羽鸡性状的选育提供快捷的分子选育方法。

具体的，所述基因型为哥伦比亚羽基因型、非哥伦比亚羽基因型；所述哥伦比亚羽基因型为z^hz^h、z^hw或z^hz^h基因型，非哥伦比亚羽基因型为z^hz^h或z^hw基因型；其中z^h表现为如seqidno.1所示序列的第33-95位插入，z^h表现为如seqidno.1所示序列的第33-95位缺失。

该方法中利用鸡的性别作为辅助，可以明确鸡哥伦比亚羽基因型。

优选的，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′。

上述引物扩增片段的大小分别为257bp或者194bp，257bp为63bp碱基序列插入，为z^h型；194bp为63bp碱基序列缺失，为z^h型。

具体的，其中z^h的pcr扩增产物大小为250bp-270bp，z^h的pcr扩增产物大小为180bp-200bp。

在实际的实验中，难以精确的辨认的pcr扩增产物大小，因此当pcr扩增产物大小为250bp-270bp时即可判断为z^h型；当pcr扩增产物大小为180bp-200bp时，即可判断为z^h型。

上述的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法在鸡育种方面的应用。

根据鸡的哥伦比亚羽基因型，可以定向的选择出特定基因型的鸡，富集某种基因型，进行品种育种。

附图说明

图1为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2中技术流程示意图；

图2为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2中构建的羽色分离遗传群体示意图；

图3为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2中羽色分离资源群体中pcr扩增以后的电泳检测结果图；其中1-12泳道为待测鸡的基因型，m为marker；

图4为本发明鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例3中7个不同品种中pcr扩增以后的电泳检测结果图；其中1-12泳道为待测鸡的基因型，m为marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物的实施例1

本实施例中鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒的实施例1

本实施例中鸡哥伦比亚羽基因型的检测试剂盒中包括：检测引物，2×taqpcrmastermix，ddh2o。其中2×taqpcrmastermix由康维世纪生物科技有限公司提供，产品编号lot01036/30146。

检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例1

本实施例中的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，包括以下步骤：

1)以待测鸡的基因组dna为模板，用检测引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′。

2)对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果鉴定鸡哥伦比亚羽的基因型。

上述步骤1)中pcr扩增反应体系为：2×taqpcrmastermix5μl、p-f0.5μl、p-r0.5μl、dna模板1.0μl、ddh2o3μl。

上述步骤1)pcr扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环；72℃延伸10min。

上述步骤2)中琼脂糖凝胶浓度为2.0％。

上述步骤2)中琼脂糖电泳缓冲液浓度为1×tbe。

上述步骤2)中琼脂糖电泳电压为120v，电流110a，电泳时间为30min。

所述基因型为哥伦比亚羽基因型、非哥伦比亚羽基因型；所述哥伦比亚羽基因型为z^hz^h、z^hw或z^hz^h基因型，非哥伦比亚羽基因型为z^hz^h或z^hw基因型；其中z^h表现为如seqidno.1所示序列的第33-95位插入，z^h表现为如seqidno.1所示序列的第33-95位缺失；其中z^h的pcr扩增产物大小为250bp-270bp，z^h的pcr扩增产物大小为180bp-200bp。

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2

本实施例的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤：

1)试样的制备与保存

黄麻羽固始公鸡15只、哥伦比亚羽豫粉1号蛋鸡配套系h系母鸡150只，并以此为亲本构建遗传群体(如图2所示)，其中f1代哥伦比亚羽公鸡39只和黄麻羽母鸡38只；f2代鸡是2只f1代哥伦比亚羽公鸡与20只f1代黄麻羽母鸡进行杂交的后代，包括哥伦比亚羽公鸡181只、哥伦比亚羽母鸡212只、黄麻羽公鸡192只和黄麻羽母鸡186只；f3代a组选择f2的哥伦比亚羽公鸡和哥伦比亚羽母鸡杂交，产生哥伦比亚羽公鸡36只、哥伦比亚羽母鸡18只和黄麻羽母鸡22只；b组选择f2的哥伦比亚羽公鸡和黄麻羽母鸡杂交，产生哥伦比亚羽公鸡15只、哥伦比亚羽母鸡16只、黄麻羽公鸡15只和黄麻羽母鸡14只。采取待测鸡离体组织器官或血液，用蛋白酶k法提取dna，将dna样品保存于4℃冰箱备用。

2)引物设计

根据哥伦比亚羽鸡rai14基因序列的上游区域(nc_006127.5g10407224)的一段参考序列上下游序列，覆盖63bp碱基插入位点，设计如下引物对p：

上游引物p-f：5′-cgtatacacagcctggcctaa-3′；

下游引物p-r：5′-attcctgtgtgtggtggagtg-3′。

3)pcr扩增

pcr扩增的反应体系为：2×taqpcrmastermix5μl、p-f0.5μl、p-r0.5μl、dna模板1.0μl、ddh2o3μl。

pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

4)基因型检测

pcr扩增产物采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液浓度为1×tbe，电压为120v，电流为110a，电泳时间30min，用凝胶电泳成像系统显像，得到电泳图谱，根据电泳图谱，检测基因型，具体依据为：

若只有257bp的片段，则为哥伦比亚羽纯合基因型(表型为哥伦比亚羽)，对应基因型为z^hz^h或z^hw。z^hz^h基因型个体的两条z^h染色体或z^hw基因型个体的z^h染色体在rai14基因序列的上游区存在63bp碱基插入。

若存在257bp和194bp的片段，则为哥伦比亚羽杂合基因型(表型为哥伦比亚羽)，对应基因型为z^hz^h。z^hz^h基因型个体的z^h染色体在rai14基因序列的上游区存在63bp碱基插入；z^hz^h基因型个体的z^h染色体在rai14基因序列的上游区不存在63bp碱基插入。

若只有194bp的片段，则为非哥伦比亚羽纯合基因型(表型为非哥伦比亚羽)，对应基因型为z^hz^h或z^hw。z^hz^h基因型个体的两条z染色体或z^hw基因型个体的z染色体在rai14基因序列的上游区不存在63bp碱基插入。

5)检测结果

具体的检测结果如图3所示。

黄麻羽固始公鸡分型结果为一条带，如图3中泳道7，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hz^h型(非哥伦比亚羽纯合)；豫粉1号蛋鸡h系母鸡分型结果为一条带，如图3中泳道1，pcr扩增产物序列长度经过测序为257bp，判定其基因型为z^hw型(哥伦比亚羽纯合)。

f1代公鸡(表型为哥伦比亚羽)分型结果为两条带，见图1中的泳道4；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp和257bp，判定其基因型为z^hz^h。f1代母鸡(表型为黄麻羽)分型结果为一条带，见图3中的泳道8；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型。

f2代鸡中的哥伦比亚羽公鸡分型结果为两条带，见图3中的泳道5；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp和257bp，判定其基因型为z^hz^h。f2代鸡中的哥伦比亚羽母鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道2；pcr扩增产物序列长度经过测序为257bp，判定其基因型为z^hw型。f2代鸡中的黄麻羽公鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道9；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hz^h。f2代鸡中的黄麻羽母鸡分型结果为一条带，见图1中的泳道10；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型。

f3代鸡中的哥伦比亚羽公鸡分型结果为两条带，见图3中的泳道6；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp和257bp，判定其基因型为z^hz^h。f3代鸡中的哥伦比亚羽母鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道3；pcr扩增产物序列长度经过测序为257bp，判定其基因型为z^hw型。f3代鸡中的黄麻羽公鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道11；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hz^h。f2代鸡中的黄麻羽母鸡分型结果为一条带，见图3中的泳道12；pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型。

利用本发明对羽色分离资源群体的分型结果见表1，从表1可见利用该方法对f0、f1、f2、f3a组和b组鸡进行基因型鉴定结果与相应表型几乎完全一致，表明本方法鉴定结果是可靠的，也是正确的。此外，f1、f2、f3a组和b组鸡的羽色分离的遗传规律均符合孟德尔遗传规律，表明可以通过本发明的方法根据其基因型来判断待测鸡的羽色表型。

表1羽色分离资源群体中的哥伦比亚羽位点的判型结果

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例3

本实施例的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法，主要包括以下步骤：

1)试样的制备与保存

固始鸡96只(黄麻羽)，卢氏鸡96只(黄麻羽)，长顺鸡绿壳蛋鸡96只(黄羽)，固始鸡和安卡鸡杂交的f2资源群体96只(gxaf2，黄羽)，隐性白羽鸡96只(白羽)，淅川乌骨鸡96只(白羽)，aa鸡96只(白羽)，东乡鸡绿壳蛋鸡96只(黑羽)。采取待测鸡离体组织器官或血液，用蛋白酶k法提取dna，将dna样品保存于4℃冰箱备用。

步骤2)、步骤3)和步骤4)同鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的实施例2。

5)检测结果

检测结果如图4中所示。固始鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道1，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型；卢氏鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道2、3，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型；长顺鸡绿壳蛋鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道4，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型；固始鸡和安卡鸡杂交的f2资源群体分型结果为一条带，见图4中的泳道5、6，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型；淅川乌骨鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道7、8，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型；aa鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道9、10，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型；东乡绿壳蛋鸡分型结果为一条带，见图4中的泳道11、12，pcr扩增产物序列长度经过测序为194bp，判定其基因型为z^hw型或z^hz^h型。利用本发明对7个不同品种鸡的分型结果如表2所示。

表27个不同品种的鸡在哥伦比亚羽位点的判型结果

鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的应用的实施例1

本实施例的鸡哥伦比亚羽基因型的检测方法的应用，包括如下步骤：

(1)选取地方品种中突变出的哥伦比亚羽色公、母鸡；

(2)公母鸡杂交自繁，利用本发明专利的方法检测杂交后代鸡哥伦比亚羽基因型；

(3)选留携带z^hz^h基因型的公鸡和携带z^hw基因型的母鸡；

(4)将步骤(3)中得到的公母鸡杂交得到后代鸡，即为基于本分子标记(63bp插入)培育的哥伦比亚羽鸡纯系。

<110>河南农业大学

<120>一种鸡哥伦比亚羽基因型的检测引物、检测试剂盒、检测方法及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<211>257

<212>dna

<213>鸡

<221>63bp插入的rai14基因上游区域序列

<400>1

cgtatacacagcctggcctaactccaagcaatctgctccagtttatcaagtgaacatcac60

acgtttggaagttgtctgcaaacttattgacttccctgctccagtttatcaagtgaacat120

cacacgtttggaagttgtctgcaaacttattgacttccctgccacatgaactcccgtaga180

gacctgaaaacagccccttccctgatccccacagaatctccttgtgcttcctgctccact240

ccaccacacacaggaat257

<211>194

<212>dna

<213>鸡

<221>63bp缺失的rai14基因上游区域序列

<400>2

cgtatacacagcctggcctaactccaagcaatctgctccagtttatcaagtgaacatcac60

acgtttggaagttgtctgcaaacttattgacttccctgccacatgaactcccgtagagac120

ctgaaaacagccccttccctgatccccacagaatctccttgtgcttcctgctccactcca180

ccacacacaggaat194

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<221>上游引物p-f

<400>3

cgtatacacagcctggcctaa21

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<221>上游引物p-r

<400>4

attcctgtgtgtggtggagtg21