一种从怀菊花中制备菊花新木脂素A的方法及其应用与流程

本发明涉及医药，特别是一种从怀菊花中制备菊花新木脂素a的方法及其应用。

背景技术：

菊花(chrysanthemummorifoliumramat.)为菊科植物菊的干燥头状花序，始载于《神农本草经》，列为上品。其味甘、苦，性凉，主归肺、肝经，具有疏散风热、平肝明目、清热解毒的功效^[1,2]。2015版《中国药典》新增“怀菊花”这一品种，与“亳菊”、“滁菊”、“贡菊”、“杭菊”共同作为“菊花”入药，肯定了怀菊的药用地位。怀菊花[dendranthemamorifolium(ramat.)kitam]做为“四大怀药”之一，主产于河南武陟、温县地区，种植的历史较悠久，为河南道地药材之一。怀菊花具有清热解毒、疏散风热、平肝明目之功效，其中白菊花长于平肝明目，黄菊花多用于散风清热。从怀菊花中分离并鉴定1个新的双环氧木脂素类化合物，即菊花新木脂素a。实验结果显示菊花新木脂素a可以显著性降低lps诱导raw264.7细胞释放no，具有较好的抗炎效果，但至今未见有公开报导。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从怀菊花中制备菊花新木脂素a的方法及其应用，可有效解决从怀菊花中提取菊花新木脂素a，实现菊花新木脂素a作为唯一活性成分在制备抗炎药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种从怀菊花中制备菊花新木脂素a的方法，所述的菊花新木脂素a是从怀菊花中提取的活性成分，分子结构式为：

其制备方法是：怀菊花用丙酮水溶液组织破碎提取，提取液减压浓缩成浸膏，浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位；乙酸乙酯部位上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得到四个流分fr.1～4；

流分fr.3用甲醇溶解，离心，过滤除去不溶物，得子流分fr.3.1；子流分fr.3.1减压浓缩，上mci柱，依次用水、甲醇梯度洗脱，用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每100ml检识一次，合并相同流份，得到子流分fr.3.1.1-fr.3.1.7；子流分fr.3.1.6经toyopearlhw-40柱色谱，用甲醇洗脱，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每10ml检识一次，合并相同流份，得到子流分fr.3.1.6.1-fr.3.1.6.2；子流分fr.3.1.6.2用半制备hplc分离，上色谱柱，流动相为乙腈︰三氟乙酸水溶液，收集保留时间tr＝61.0～63.0min的流份，浓缩干燥，得到化合物菊花新木脂素a。

该化合物菊花新木脂素a具有显著降低lps诱导raw264.7细胞释放no，有效用于制备抗炎药物，实现菊花新木脂素a作为唯一活性成分在制备抗炎药物中的应用。

本发明制备方法易操作，科学合理，所制备的菊花新木脂素a具有显著降低lps诱导raw264.7细胞释放no，有效用于制备抗炎药物，实现菊花新木脂素a作为唯一活性成分在制备抗炎药物中的应用，开拓了抗炎药物的新途径提高了怀菊花的药用价值和商业价值，有显著的经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明化合物菊花新木脂素a的¹h-nmr谱(incd3od)图。

图2为本发明化合物菊花新木脂素a的¹³c-nmr谱(incd3od)图。

图3为本发明化合物菊花新木脂素a的dept135谱(incd3od)图。

图4为本发明化合物菊花新木脂素a的¹h-¹hcosy谱(incd3od)图。

图5为本发明化合物菊花新木脂素a的hsqc谱(incd3od)图。

图6为本发明化合物菊花新木脂素a的hmbc谱(incd3od)图。

图7为本发明化合物菊花新木脂素a的noesy谱(incd3od)图。

图8为本发明化合物菊花新木脂素a的hr-esi-ms谱(incd3od)图。

图9为本发明化合物菊花新木脂素a的ir谱(incd3od)图。

图10为本发明化合物菊花新木脂素a的uv谱(incd3od)图。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，一种从怀菊花中制备菊花新木脂素a的方法，所述的菊花新木脂素a是从怀菊花中提取的活性成分，其制备方法是：怀菊花11.2kg，用体积浓度50％的丙酮水溶液组织破碎提取2次，丙酮每次用量120l，合并2次提取液，减压浓缩得浸膏1.8kg；浸膏用9l水分散，依次用石油醚5×10l、乙酸乙酯5×10l、正丁醇5×10l萃取，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位；乙酸乙酯部位上1000g硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇50:1、30:1、20:1、5:1进行梯度洗脱，得到相应的四个流分fr.1～4；

流分fr.3用50ml甲醇溶解，用6000转的转速离心15min，温度为20℃，离心过滤除去不溶物，得子流分fr.3.1；子流分fr.3.1减压浓缩至20ml，上mci柱，依次用水、体积浓度10％、20％、30％、40％、100％甲醇洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，流速3ml/min，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每100ml检识一次，合并相同流份，得到子流分fr.3.1.1-fr.3.1.7；子流分fr.3.1.6经toyopearlhw-40柱色谱，用体积浓度70％甲醇洗脱，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每10ml检识一次，合并相同流份，得到子流分fr.3.1.6.1-fr.3.1.6.2；子流分fr.3.1.6.2用半制备hplc分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的ymc-packods-aa色谱柱，流动相为乙腈︰三氟乙酸水溶液＝23︰77，所述的三氟乙酸水溶液质量浓度万分之二，流速3ml/min，收集保留时间tr＝61.0～63.0min的流份，浓缩干燥，得到化合物菊花新木脂素a。

该化合物菊花新木脂素a具有显著降低lps诱导raw264.7细胞释放no，有效用于制备抗炎药物，实现菊花新木脂素a作为唯一活性成分在制备抗炎药物中的应用。

本发明方法经反复试用，都得到了相同或相近似的结果，表明方法稳定、可靠，具有很好的实际应用价值，所制备的化合物菊花新木脂素a具有显著性降低lps诱导raw264.7细胞释放no，具有较好的抗炎效果，并经实验取得了非常好的有效技术效果，有关资料如下：

1仪器与试药

核磁共振用brukeravanceⅲ500核磁共振仪(tms内标)(bruker)，红外光谱用nicoletis10microscopespectrometer(thermoscientific,usa)，高分辨质谱用brukermaxishdmassspectrometer，紫外光谱用shimadzuuv-2401pcapparatus，高效液相色谱用watersalliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，empower3色谱数据工作站，lc50型高压制备液相色谱仪，uv200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，ymc-packods-a色谱柱(250×10mm.d.s-5mm,12mm)(ymc有限公司)，其余有n-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，a-1000s型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，n-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，fdu-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，dfz-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，ab204-n万分之一精密分析天平(mettlertoledo)，imark型酶标仪(美国bio-rad)，二氧化碳培养箱(上海stik)，超净工作台(苏净集团)，arium611vf超级组合型超纯水器(sartorius)，倒置显微镜(nikon)，pb-10酸度计(德国赛多利斯集团)，sorvallst16rcentrifuge高速低温冷冻离心机(thermofisherscientific公司)；酶标仪(bio-rad680)；超净工作台(江苏苏净集团)；90-3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司)；rd-7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(nichipetexplus)；ab204-n电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)；10cm培养皿、96孔培养板、冻存管(corning)；普通手术器械。

柱层析填料diaionhp-20、mcigelchp-20(日本三菱化学公司)，toyopearlhw-40(日本tosoh公司)，sephadexlh-20(parmaciabiotech公司)，柱层析所用硅胶h(160-200目)为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。

小鼠巨噬细胞(raw264.7)购自中国科学院上海细胞库；dmem高糖培养基(gibco)；胎牛血清((gibco)；胰蛋白酶(gibco)，dmso(solarbio)；mtt(biosharp)；氨苄青霉素、tris碱(sigma)；griessreagent(sigma)；inos一抗(cst)、cox2一抗(cst)；水为超纯水，pbs缓冲液等为自配。

本发明所选的怀菊花，采购于河南焦作，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为菊科植物怀菊花dendranthemamorifolium(ramat.)kitam的干燥头状花序，并按本发明给出的制备方法，制备出化合物菊花新木脂素a。

2结构鉴定

菊花新木脂素a：浅黄色结晶性粉末(ch3oh)，茴香醛-浓硫酸喷雾显粉红色。hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z:571.1771[m+na]⁺(calcd.forc27h32o12na571.1791)，确定其分子式为c27h32o12；uv(meoh)λmax:206(2.42),228(0.59),284(0.23)nm；ir(kbr)νmaxcm^-1：3361,2925,1674,1597,1443,1201,1123,1036cm^-1。

菊花新木脂素a

表1菊花新木脂素a的nmr波谱数据(incd3od)

活性检测

raw264.7细胞经含胎牛血清(10％)的dmem培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，pbs洗一次，加入dmem培养基吹打均匀，以5×10⁴个/ml的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为100μl。培养24h待细胞贴壁后，细胞分为正常组(con)、模型组(lps1μg/ml)、菊花新木脂素a组(50μm+lps1μg/ml)继续培养。37℃、5％co2培养24h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入100μldmso，震荡5-10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪双波长在570-630nm下测定各孔吸光度值(a)，计算平均a值和细胞活力。实验平行重复三次。细胞活力＝各组od值/正常组od值。

选取对数生长期raw264.7细胞，以3×10⁵个/ml的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为100μl。培养24h待细胞贴壁后，细胞分为正常组(con)、模型组(lps1μg/ml)、菊花新木脂素a组(50μm+lps1μg/ml)继续培养。37℃、5％co2培养24h后，每孔吸出细胞上清液50μl，加入50μlgriess试剂，避光反应5min后，540nm下测定各孔吸光度值(a)，计算平均a值和no释放量。实验平行重复三次。no释放量＝各组od值/正常组od值。

选取对数生长期raw264.7细胞，以1×10⁵个/ml的浓度接种于6孔板内，每孔培养总体积为1ml。培养24h待细胞贴壁后，细胞分为正常组(con)、模型组(lps1μg/ml)、菊花新木脂素a组(50μm+lps1μg/ml)继续培养。37℃、5％co2培养24h后，按照试剂盒说明书仔细操作提取总蛋白(北京索莱宝科技有限公司)。总蛋白按照bca蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书仔细操作测定总蛋白终浓度，剩余的蛋白样本加入4份的loadbuffer100℃煮5min变性，根据总蛋白浓度调整上样蛋白浓度后经sds-page电泳分离后转移至pvdf膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1.5h，加入一抗inos(1:1500)、cox2(1:1500)、、β-actin(1:2000)。4℃孵育过夜，加入兔源荧光二抗(1:20000)，于37℃孵育1h，近红外双色成像系统(奥德赛)采集蛋白条带，并用imagestudio软件对蛋白条带进行定量分析。

活性结果

mtt与griess结果显示，1μg/ml的lps可诱导raw264.7细胞增殖与no释放增加，但菊花新木脂素a(50μm)可降低no的释放且不杀伤raw264.7细胞；westernbolt结果显示，1μg/ml的lps可使raw264.7细胞过度表达inos与cox2蛋白，但菊花新木脂素a(50μm)显著性下调raw264.7细胞的inos与cox2蛋白表达，结果表明菊花新木脂素a具有较好的抗炎效果，作为唯一活性成分显著性降低lps诱导raw264.7细胞释放no，有效用于制备抗炎药物，开拓了抗炎药物的新途径和怀菊花的新用途和商业价值，有显著的经济和社会效益。