玉米矮化病诱导基因P3a及其遗传转化体系的构建方法和应用与流程

本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种玉米矮化病诱导基因p3a及其遗传转化体系的构建方法和应用。

背景技术：

玉米作为我国种植面积最大的农作物之一，是我国重要的经济作物。玉米矮化病是一类由虫传病毒引起的疾病，包括：①玉米粗缩病导致的矮化植株，病株明显矮于正常植株，叶色浓绿、叶片宽、短、厚，上部节间短缩，不能抽穗结实；②玉米矮花叶病导致的矮化植株，病株叶片只有叶脉是绿色，其它部分均为黄色，表现为黄绿相间的条纹，叶片组织变硬、变脆、容易折断。

玉米在整个生长周期都会患矮化病，对产量影响较大，且感病越早对产量的影响越严重，目前的防治方法包括：选用抗性品种、减少毒源、消灭病毒传播等，其中后两个方案需要在育种管理上投入大量的人力物力，管理上具有一定难度。而选用抗性品种通常被认为是更经济环保的解决方案，但抗性品种的培育周期较长，品种较少，且抗性品种的其它性能并不一定都能满足人们的需求。

目前，对于选用抗矮化病品种方面，大多通过田间杂交的方式进行选育，很少用到遗传育种的手段，主要原因即在于目前对玉米矮化病的致病分子机理的研究尚处于初步阶段，因此，了解玉米矮化病病毒的毒性和致病性遗传基础，具有重要意义。本发明从致病源出发，通过发现能够引起玉米矮化病的致病基因，为玉米矮化病致病机理的研究提供理论依据，为进一步开发更加高效的防治手段提供可能。

shachen等人于2016年在viruses杂志上发表的一篇题为“characterizationofanovelpolerovirusinfectingmaizeinchina”的文章，披露了一种新型病毒——玉米黄花叶病毒maymv，该maymv病毒侵染玉米导致玉米产生矮化、黄化症状，严重影响了玉米的产量和品质。目前，在我国的云南、贵州、安徽等地均检测到了maymv危害玉米，maymv在东非等国家也有发生危害。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玉米矮化病诱导基因p3a及其遗传转化体系的构建方法和应用，以提供一种玉米矮化病诱导相关基因，为研究玉米矮化病致病机理及玉米矮化病的控制方法奠定基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种玉米矮化病诱导基因p3a，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，全长135bp，该p3a基因来源于玉米黄花叶病毒(maymv)，用于编码maymv的一个蛋白。

本发明还提供了上述玉米矮化病诱导基因p3a的遗传转化体系的构建方法，该遗传转化体系为多克隆位点上依次顺式连接有启动子、所述玉米矮化病诱导基因p3a和终止子的植物表达载体，所述构建方法的步骤包括：

步骤s1：玉米矮化病诱导基因p3a的克隆；

步骤s2：植物表达载体的构建，获得所述玉米矮化病诱导基因p3a的遗传转化体系。

进一步优选地，所述步骤s1中，p3a的克隆方法包括：利用引物f：gcgatatcatagattggaaactcttttgc和r：atctatagcctcccgtattcattcacaat在玉米黄花叶病毒中扩增p3a基因，将扩增的目的序列利用ecorv酶切位点连接到pmd19-t载体上保存备用。

进一步优选地，植物表达载体为多克隆位点上依次顺式连接有35s启动子、p3a基因、flag标签和终止子的植物表达载体pcambia3301，即35s::maymvp3a-flag植物表达载体；

植物表达载体的构建及转化方法步骤包括：

利用引物：

f：cataccatttacgaacgataggtcgacatacagaagcttcgaagatagc

r：gtcgtggtccttatagtcgtcgaccctcccgtattcattcacaat

在玉米黄花叶病毒中扩增p3a基因，将扩增的目的序列利用一步克隆法连接到puc19-2x35s-3xflag载体上构建带有flag标签的p3a植物表达载体保存备用；

利用引物：

f：catgccatggatacagaagcttcgaagatagc

r：ctggtcacccttatcgtcatcgtctttg

扩增上述制备获得的带有flag标签的p3a植物表达载体，获得带有flag标签的目标基因p3a+flag序列，利用ncoi和bsteii酶切位点将p3a+flag序列连接到植物表达载体pcambia3301，构建35s::maymvp3a-flag植物表达载体，即为所述玉米矮化病诱导基因p3a的遗传转化体系。

本发明还提供了上述玉米矮化病诱导基因p3a在调控玉米生长发育中的应用。

本发明还提供了上述玉米矮化病诱导基因p3a在降低玉米矮化病致病性的应用。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种玉米矮化病诱导基因p3a及其遗传转化体系的构建方法和应用，该玉米矮化病诱导基因p3a能够诱导玉米矮化，为诱导玉米矮化病的一种关键基因，该基因的发现，填补了玉米矮化病致病机制研究的空白，为后期研究玉米矮化病分子机制、开发玉米抗矮化病新品种、研究防治玉米矮化病新方法提供了理论依据。

附图说明

图1为农杆菌介导遗传转化t1代玉米再生苗pcr检测结果图；

图2为转基因玉米与正常玉米株高比较结果图；

图3为试纸条检测转基因玉米阳性苗。

具体实施方式

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1玉米黄花叶病毒株的rna提取

取感染玉米黄花叶病毒的活体玉米植株，利用rna提取试剂盒提取感病植株的叶片总rna，并将rna反转录成cdna。

2.2玉米矮化病诱导基因p3a的克隆

利用引物f：cataccatttacgaacgataggtcgacatacagaagcttcgaagatagc和r：gtcgtggtccttatagtcgtcgaccctcccgtattcattcacaat，以cdna为模板扩增p3a基因，将扩增获得的p3a基因连接到带有flag标签的puc19-2x35s-3xflag载体上，构建获得带有flag标签的植物表达载体，送去上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2.3遗传转化体系的构建

所述遗传转化体系为多克隆位点上依次顺式连接有35s启动子、带有flag标签的p3a基因和终止子的pcambia3301载体，即35s::maymvp3a-flag植物表达载体，该植物表达载体的构建方法步骤包括：

2.3.1将35s启动子连接到pcambia3301载体的多克隆位点；

2.3.2利用引物f：catgccatggatacagaagcttcgaagatagc和r：ctggtcacccttatcgtcatcgtctttg扩增上述制备获得的带有flag标签的植物表达载体，获得带有flag标签的目标基因p3a+flag序列，利用ncoi和bsteii酶切位点将p3a+flag序列连接到植物表达载体pcambia3301。

以上操作参照基因工程实验手册进行，构建获得35s::maymvp3a-flag植物表达载体，即为所述玉米矮化病诱导基因p3a的遗传转化体系，用于转基因试验。

2.4转化

将载体质粒通过电击法转入农杆菌eha105中，pcr进行鉴定，获得含有p3a基因的农杆菌遗传转化体系。

2.5农杆菌介导玉米遗传转化

委托未米生物科技(江苏)有限公司进行玉米遗传转化，具体操作步骤包括：以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8ml悬浮液的2ml塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0ml步骤2.4的农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到静息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后新的筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

对t1代再生苗利用pcr方法检测转基因玉米筛选标记bar基因，pcr引物f：taggtcgacatacagaagct和r：tgccctcccagctgct，目的条带大小269bp，阴性对照为转空载体玉米。结果如图1所示，图中可以看出，采用bar基因筛选获得阳性转基因苗数量大于50株。

2.6转基因玉米矮化性状检测

选取步骤2.5检测的50株阳性转基因苗，标记后，与正常同龄的转空载体野生型苗种混合种植于大田中，结果发现，50株阳性转基因苗种有32株表现出矮化症状，如图2所示，说明该基因对玉米具有致矮化病作用。

再利用筛选标记bar基因检测试纸条对32株转基因植株进行检测，以野生型玉米为对照，结果如图3所示，图3中，野生型无bar基因条带，转基因植株均检测到了bar基因，图3说明外源基因p3a转入玉米植株，并使玉米产生矮化症状。

2.7玉米矮化病诱导基因p3a的应用

如上述实验结果可知，玉米矮化病诱导基因p3a侵入玉米基因组后，能够诱导玉米矮化病，对此，可以利用基因互作技术筛选玉米中与致病蛋白p3a互作的玉米蛋白，再利用基因沉默技术来调控感病玉米植株中的互作蛋白的表达，或将玉米中与p3a互作的基因修改，最终使玉米不受p3a致病影响，达到抗病毒的目的。该研究内容为后期制定玉米抗病毒育种策略提供了理论依据。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。