以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，与其它蚊媒黄病毒如登革热、西尼罗河和日本脑炎病毒密切相关。寨卡病毒有一个长度约11kb的阳性单链rna基因组，在5′和3′端有一个单独的开放阅读框，两侧有两个未翻译的区域。单个orf编码一个多蛋白，分裂后产生3种结构（衣壳、膜前体和包膜蛋白）和7种非结构蛋白。寨卡病毒菌株可分为两个不同的系统发育谱系（非洲和亚洲谱系）。与其他黄病毒相似，寨卡病毒主要由伊蚊传播，包括城市和郊区的蚊子白纹伊蚊和埃及伊蚊，也与登革病毒和甲病毒的传播有关，如基孔肯雅病毒。尽管城市和郊区的传播周期涉及人类蚊子的传播，但森林传播周期显然涉及非人类灵长类作为主要病毒库。此外，寨卡病毒可在怀孕期间从母亲传给发育中的胎儿，或在围产期传给婴儿。最重要的是，病毒可以通过精液或阴道分泌物在性交过程中传播。此外，寨卡病毒可能通过输血传播，最近巴西报道了通过输注血小板浓缩物传播。

尽管绝大多数感染者（约80%）仍无症状，但寨卡病毒可引起广泛的临床表现，从轻度急性发热性疾病到严重的神经系统疾病（即格林巴利综合征），以及破坏性的先天性异常，包括小头畸形、眼畸形和其他神经系统疾病。逻辑缺陷。然而，在有临床表现的成年个体中，这些症状通常是轻微的、自我限制的、非特异性的，与以低度（-38°c）和短期（2-7天）发热、疲劳、皮疹、关节痛、肌痛、头痛和结膜炎为特征的急性发热性疾病有关。这些临床症状与许多其他黄病毒或α病毒感染引起的症状是不可区分的。因此，必须对寨卡病毒进行实验室诊断，以确认临床诊断。因此，快速、可靠、成本相对较低的诊断工具的可用性对寨卡病毒的控制和管理至关重要。目前，寨卡病毒感染的临床诊断依赖于检测抗体的血清学分析（包括快速侧流免疫色谱分析、igm捕获酶联免疫吸附试验、血小板减少中和试验和检测病毒核酸的分子基础分析。常规的或定量的，实时的逆转录聚合酶链反应。由于与其他黄病毒的广泛抗体交叉反应性，血清学分析不能提供合适的特异性。相比之下，用于检测寨卡病毒rna的分子分析具有高通量、敏感性和高度特异性。

高分辨率熔解曲线技术可作为一种新的寨卡病毒核酸的检测手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行核酸检测，具有操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、pcr产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。该方法可为口岸寨卡病毒核酸检测和寨卡病毒的防控提供技术支撑。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法可作为寨卡病毒新的检测手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行寨卡病毒检测，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、pcr产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。并提供其操作方法。

本发明是由以下技术方案来实现的：

本发明设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒特异性检测引物，序列如下：

ns3-f：5’-gctatgggatgtgcctgctc-3’

ns3-r：5’-tcccttcaccgcttctca-3’。

利用上述的检测引物，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒，包括如下成分：

1）寨卡病毒ns3基因的特异性引物

ns3-f：5’-gctatgggatgtgcctgctc-3’

ns3-r：5’-tcccttcaccgcttctca-3’。

2）pcr混合液：faststarttaqdna聚合酶，反应缓冲液，dntp混合液，resolight饱和荧

光染料；

3）寨卡病毒基因组逆转录的cdna；

4）ddh2o；

5）25mmmgcl2。

本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测方法，它包括如下步骤：

1）高分辨率熔解曲线模板寨卡病毒基因组rna的制备

使用takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0试剂盒(takara公司)，参照试剂盒说明提取寨卡病毒基因组rna。

2）寨卡病毒基因组rna逆转录成cdna

使用primescript™ii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒(takara公司)，参照试剂盒说明将寨卡病毒基因组rna逆转录成cdna。

3）高分辨率熔解曲线反应体系：

30μl反应体系包括：faststarttaqdna聚合酶0.5μl，寨卡病毒基因组逆转录的cdna模板2μl，dntp混合液2μl，resolight饱和荧光染料1μl，ns3-f引物1μl，ns3-r引物1μl，反应缓冲液3μl，25mmmgcl23.6μl，ddh2o15.9μl。

4）高分辨率熔解曲线反应程序：

94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。

pcr结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用lightcycler®480genescanningsoftware软件分析高分辨率熔解曲线。

本发明的一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及操作方法，根据寨卡病毒ns3基因序列设计特异性引物，可对寨卡病毒rna进行检测，与现有检测手段相比，本发明的有益效果在于：

1）可对寨卡病毒rna的灵敏性和特异性进行有效检测。

2）本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强。

3）操作简单、速度快，当天即可出具结果。

4）pcr产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。

附图说明

图1：寨卡病毒和其他对照病毒以及阴性对照的ns3pcr结果图，图中，从左到右依次是dl2000、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、阴性对照。

图2：寨卡病毒和其他对照病毒以及阴性对照的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。

图3：寨卡病毒重复性的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。

图4：寨卡病毒ns3基因重组质粒的质粒重复性和敏感度的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。

具体实施方式

实施例1

本实施例设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒特异性检测引物，序列如下：

ns3-f：5’-gctatgggatgtgcctgctc-3’

ns3-r：5’-tcccttcaccgcttctca-3’。

利用上述的检测引物，提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒，包括如下成分：

1）寨卡病毒ns3基因的特异性引物

ns3-f：5’-gctatgggatgtgcctgctc-3’

ns3-r：5’-tcccttcaccgcttctca-3’。

2）pcr混合液：faststarttaqdna聚合酶，反应缓冲液，dntp混合液，resolight饱和荧

光染料；

3）寨卡病毒基因组逆转录的cdna；

4）ddh2o；

5）25mmmgcl2。

实施例2

本实施例提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测方法，它包括如下步骤：

1）高分辨率熔解曲线模板寨卡病毒基因组rna的制备

使用takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0试剂盒(takara公司)，参照试剂盒说明提取寨卡病毒基因组rna。

2）寨卡病毒基因组rna逆转录成cdna

使用primescript™ii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒(takara公司)，参照试剂盒说明将寨卡病毒基因组rna逆转录成cdna。

3）用pcr验证设计的特异性引物

30μl反应体系包括：faststarttaqdna聚合酶0.5μl，寨卡病毒基因组逆转录的cdna模板2μl，dntp混合液2μl，resolight饱和荧光染料1μl，ns3-f引物1μl，ns3-r引物1μl，反应缓冲液3μl，25mmmgcl23.6μl，ddh2o15.9μl。

94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。

4）高分辨率熔解曲线反应体系：

30μl反应体系包括：faststarttaqdna聚合酶0.5μl，寨卡病毒基因组逆转录的cdna模板2μl，dntp混合液2μl，resolight饱和荧光染料1μl，ns3-f引物1μl，ns3-r引物1μl，反应缓冲液3μl，25mmmgcl23.6μl，ddh2o15.9μl。

5）高分辨率熔解曲线反应程序：

94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。

pcr结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用lightcycler®480genescanningsoftware软件分析高分辨率熔解曲线。

6）以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒核酸检测方法的重复性，以及以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒ns3基因重组质粒的质粒重复性和敏感度检测。

7）结果：寨卡病毒ns3pcr扩增出条带，对照病毒和阴性对照均未扩增出条带，基因测序并用ncbiblast比对，比对结果为寨卡病毒。利用lightcycler®480genescanningsoftware软件分析高分辨率熔解曲线，明确了了寨卡病毒的扩增曲线。以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒核酸检测方法的重复性和以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒ns3基因重组质粒的质粒重复性结果均较好，以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒ns3基因重组质粒的敏感度为10³拷贝。

8）结论：本发明首次利用高分辨熔解曲线特异性检测寨卡病毒rna，拓展了寨卡病毒rna检测的视角。本发明利用基于寨卡病毒rnans3基因的高分辨熔解曲线也是寨卡病毒rna检测的一个新方向。本试剂盒操作简单、速度快、pcr产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作，可对寨卡病毒rna的灵敏性和特异性进行有效检测。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

序列表

<110>山东国际旅行卫生保健中心

<120>以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法

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<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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