一种解淀粉类芽孢杆菌BREC-10及其菌剂和应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉类芽孢杆菌 BREC-10及其菌剂和应用。

背景技术：

在我国每年都会产生大量的畜禽粪便，而大多数粪便得不到有效的利用，导致各种环境问题(重金属污染土壤，空气污染，资源的浪费)，但是畜禽粪便含有丰富的有机质，含水量高，多种营养元素，相比于其他农业废弃物便于集中和运输。是一种潜在的生物质能源产出原料。

天然的纤维素由于其结构复杂，任何单一的酶都难以高效的水解他，需要纤维素酶系共同的作用，纤维素酶系的组成成分可以分为三类：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。实际生产中商用纤维素酶都来源于真菌，细菌来源的细菌纤维素酶鲜有报道，但是细菌在纤维素产酶方面具有潜在的优势，其生长速率快，酶系全面，可以用碳源的较多的有势。

纤维素酶生产过程中需要大量的碳源，氮源，这样提高了纤维素酶的生产成本，而以农业废弃物为碳、氮源生产纤维素酶，则会降低成本，更利于商业化应用。本发明公开了一种利用牛粪产酶的类芽孢杆菌BREC-10，与地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌等菌构建的复合发酵液，在堆肥过程中缩短发酵周期，提前启动高温阶段，增加N素含量。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用牛粪产酶的类芽孢杆菌 BREC-10，该菌株可在不添加氮源的条件下，利用牛粪产纤维素酶，以农业废弃物为碳、氮源生产纤维素酶，降低了成本。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供的一种解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus) BREC-10，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2017年9月15日，保藏编号：GDMCC No.60238。

本发明菌株BREC-10是革兰氏阳性好氧菌，可移动，产芽孢短杆状的细菌，其G+C含量是41mol％，主要脂肪酸是有iso-C15:0, iso-C14:0,C16:0,C18:0。

本发明解淀粉类芽孢杆菌BREC-10的16S rRNA序列为：SEQ ID NO:1。

本发明的另一个目的在于提供上述解淀粉类芽孢杆菌BREC-10 或其菌悬液或其培养液或其发酵产物的菌剂。

所述的菌剂中含有解淀粉类芽孢杆菌BREC-10的总活菌数高于 2×10⁷个。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂包括上述解淀粉类芽孢杆菌BREC-10、枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌，以活菌体的数目计，所述的解淀粉类芽孢杆菌BREC-10含量为0.01-0.3份，所述枯草芽胞杆菌含量为0.05-0.2份，所述的地衣芽胞杆菌含量为0.05-0.2份。

在本发明的另一方面，提供了所述的解淀粉类芽孢杆菌BREC-10 或其菌悬液或其培养液或其发酵产物在利用牛粪产酶中的应用。

在本发明的另一方面，提供了所述的解淀粉类芽孢杆菌BREC-10 或其菌悬液或其培养液或其发酵产物在堆肥制备过程中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明菌株BREC-10能利用牛粪在不添加任何氮源的条件下产生纤维素酶，且保持很高的纤维素酶活性，菌株BERC-10具有很好的碳源光谱性，可以利用玉米秸秆，大豆秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，因此可以广泛用于含木质纤维素物质的预处理，为木质纤维素物质的产业化提供帮助。

附图说明

图1是pH对菌株BREC-10利用牛粪产酶的影响；

图2是温度对菌株BREC-10利用牛粪产酶的影响；

图3是接种量对菌株BREC-10利用牛粪产酶的影响；

图4是不同氮源对产酶的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株的分离鉴定

菌株BREC-10分离于云南西双版纳傣族自治州采集的竹虫肠道样品中。

选取10只虫体，表皮消毒，在无菌操作台中抽取肠道，放入无菌水中充分匀浆，吸取匀浆液5ml放入100ml改良的赫奇逊无机盐培养基(KH2PO4 1.0g，NaCl 0.1g，MgSO47H2O 0.3g,NaNO3 2.5g FeCl3 0.01g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 5g，纤维素类物质0.5g H2O 1L)中30℃， 150rmp/min.培养36h后，采用平板稀释涂布的方法分离菌株，将100ul 稀释液均匀涂布于CMC发酵培养基的平板上，30℃恒温倒置培养36h，挑取单菌落划线培养，直至纯化至单一菌株，将挑取的单一菌株点接到CMC发酵固体平板，30℃培养3d后，刚果红染色初筛纤维素降解菌。

对分离到的菌株进行形态学观察、生理生化试验、16S rRNA 基因序列分析以及细胞化学组分分析。

菌株BREC-10是革兰氏阳性好氧菌，可移动，产芽孢短杆状的细菌，其G+C含量是41mol％，主要脂肪酸是有iso-C15:0,iso-C14:0, C16:0,C18:0。

其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，提交GenBank中登录号为MF384324，16S rRNA基因序列分析菌株BREC-10与 Paenibacillus amylolyticus的相似性为99.28％.基于以上分析确定 BREC-10为解淀粉类芽孢杆菌。

基于以上特征，将菌BREC-10鉴定为解淀粉类芽孢杆菌 (Paenibacillus amylolyticus)。该菌株于2017年9月15日寄存于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No.60238。

实施例2BREC-10不添加氮素情况下利用牛粪产纤维素酶

将菌株以改良的HM培养基(KH2PO4 1.0g，NaCl 0.1g， MgSO47H2O 0.3g,NaNO32.5g,FeCl3 0.01g,CaCl2 0.1g,CMC-Na 5g，玉米秸秆0.5g H2O 1L)培养，利用单因素试验，验证最佳的产酶ph，温度及接种量，实验设置pH 2-8的不同实验组，温度15到50℃不同的培养温度，1％到10％的不同接种量。

结果如图1～3所示，通过单因素试验确定产酶的pH为7，最佳温度是30℃，最佳接种量6％。

将BREC-10接种以秸秆为碳源，含有不同氮源(NaNO3 (NH4)2SO4，NH4ON3，NH4Cl，yeast and cattle manure)，30℃培养 3天，测定cmc酶活力结果如图4所示，其中以yeast和cattle manure 为氮源的处理组产酶达到2.13和1.7U/ml/min。

实施例3微生物菌剂的制备

在100重量份的培养基(葡萄糖10g，玉米浆20g，蛋白胨1g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2)中接种5重量份的枯草芽胞杆菌菌液(枯草芽胞杆菌的菌种可以通过商购得到，购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为19374，LB培养基中培养至10⁸个的活菌体浓度，得到菌液)，30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽胞杆菌的活菌数为2×10⁷个/克的培养基。

在100重量份的培养基(玉米浆4.5g，酵母粉2.50g，豆饼粉浸汁为1：15，葡萄糖1.50g，pH值7.0)中接种5重量份的地衣芽胞杆菌菌液(地衣芽胞杆菌的菌种可以通过商购得到，所述地衣芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为02367，LB培养基中培养至10⁸个的活菌体浓度，得到菌液)，30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽胞杆菌的活菌数为2×10⁷个/克的培养基。

在100重量份的培养基(豆饼粉200g，葡萄糖10g，硫酸铵5g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.8g，硫酸亚铁0.05g， pH7.0)接种4重量份的解淀粉类芽胞杆菌BREC-10菌液(实验室分离于竹虫肠道，且进行了专利保藏，同LB培养基中培养至10⁸个的活菌体浓度，得到菌液)，37℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至解淀粉芽胞杆菌的活菌数为2×10⁷个/克的培养基。

将分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉类芽胞杆菌、按照比例进行混合，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述枯草芽胞杆菌的含量为0.1份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.1份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.3份，得到本实施例的微生物菌剂。

实施例4微生物菌剂性能

将牛粪和秸秆混合后调节碳氮比至(25～30):1之间，水分控制在60％左右。试验共分为菌剂组、对照组这2组，每组3次重复，每组物料初始质量均为20kg。菌剂组为每千克物料喷施5mL自制菌剂(实施方案3)并混合均匀。

对照组只添加相同体积的无菌水。菌剂和物料充分混匀后分别放置于露天，每3d翻堆1次。

试验期间测量温度，取温度平均值作为堆体温度。总有机碳含量采用重铬酸钾容量－外加热法测定，总氮含量采用凯氏定氮法测定。碳氮比(C/N)为总有机碳含量和总氮含量的比值。

结果表明：接种复合微生物菌剂的菌剂组堆体最高温度为70.1.℃, 高温维持8d，对照组堆体最高温度为60℃，高温维持7d：菌剂组碳氮比从30下降到12.6，对照组碳氮比从30下降到16。菌剂组和对照组堆肥均达到了腐熟无害化标准，接种复合菌剂可以显著提高堆肥温度，缩短堆肥周期，保证堆肥质量。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 农业部沼气科学研究所

<120> 一种解淀粉类芽孢杆菌BREC-10及其菌剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1394

<212> DNA

<213> 解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)

<400> 1

gcagtcgagc ggattgataa gaagcttgct tccttgatgc ttagcggcgg acgggtgagt 60

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