本发明属于基因工程技术领域，更具体地涉及一种猫细小病毒vp2蛋白，以及用昆虫细胞表达体系表达猫细小病毒的病毒样颗粒(vlp)；还涉及所获得的重组病毒样颗粒，及其在猫细小病毒疫苗研制中的应用。
背景技术：
猫泛白细小减少症是由猫细小病毒(felinepanleukopeniavirus,fpv)引起的一种高度接触性急性传染病，具有很高的发病率和死亡率。患病动物表现为高热、呕吐、腹泻、白细胞数目严重减少和肠炎等症状。该病毒在自然条件下感染猫科和鼬科多种动物，如虎、豹、狮子和浣熊，但以体型较小的猫科动物，包括水貂最为易感。该病每年对动物养殖业带来重大经济损失。
猫细小病毒属细小病毒科细小病毒属，为单股负链线性dna病毒，无囊膜，对物理化学因素具有很强的抵抗力。fpv病毒基因组编码2种结构蛋白(vp1、vp2)和2种非结构蛋白(ns1、ns2)，其中vp2结构蛋白是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。
杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链dna，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(acmnpv)。acmnpv病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链dna，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(andersonetal.,1995；wangetal.,2001；ribeiroetal.,2001)。
目前市场上还没有应对fpv的特效药和有效的治疗办法，临床上以免疫预防为主，但是国内还没有真正批准上市的fpv疫苗。所以需要研制一种安全、有效的亚单位疫苗来填补市场的空白。
技术实现要素：
本发明提供一种猫细小病毒vp2蛋白及制备的病毒样颗粒，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种猫细小病毒中筛选获得的新型的vp2蛋白，其氨基酸序列为seqidno:2；
本发明还对上述的vp2蛋白进行优化，优化后的蛋白的氨基酸序列为seqidno:4；
编码上述vp2蛋白的基因，其核苷酸序列为seqidno:3；
本发明还提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码vp2蛋白的核苷酸片段；
本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备猫细小病毒的病毒样颗粒；
本发明再一个方面提供一种猫细小病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。
所述的昆虫细胞为昆虫细胞sf9；
本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；
本发明还提供一种猫细小病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明制备的病毒样颗粒；
本发明制备的疫苗免疫猫后能提高猫的抗体滴度，预防猫细小病毒的感染。
具体实施方式
本发明对猫细小病毒的vp2的cdna全序列分别进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cdna序列，构建了杆粒载体，并在昆虫细胞中成功地表达出可溶性的重组蛋白，该蛋白在体内自动组装成病毒样颗粒(vlps)，vlp在空间构想上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于vlp不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高。此外，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的fpv-vlp产量显著高于猫肾细胞培养的病毒，生产成本明显降低。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
实施例1：vp2基因的扩增及序列分析
2018年收集疑似猫细小病料进行处理，将病料进行常规分离、鉴定，判定为猫细小用猪红细胞进行ha检测，血凝价为7log2。用已知的猫细小血清进行hi试验，结果交叉反应差；证明致病的猫细小病毒株发生了突变。
1、扩增猫细小vp2基因
根据ncbi中发表的猫细小vp2基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：
primer1：5′-atgagtgatggagcagttcaacc-3′；
primer2：5′-ttaatataattttctaggtgctagttg-3′。
提取分离的猫细小核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行pcr扩增目的片段，经序列测定，其核苷酸序列为seqidno:1，编码的氨基酸序列为seqidno:2。
与ncbi中已公布的猫细小vp2蛋白(aaa47152.1)进行比对分析，发现多个位点发生了变异，其中第80位(k变s)，第87位(m变v)，第232位(i变v)，第267位的(f变c)，第564位(n变r)，第568位的(a变g)位点发生了变异。结果表明分离的毒株为新的细小病毒，含有新的vp2抗原蛋白。
2、vp2基因的剪切、优化
将分离毒株的结构蛋白基因vp2的抗原位点进行了分析，将其n端32aa删除，加入m氨基酸，c端9aa删除，同时将密码子进行优化；优化修饰后的序列为能很好地表达出抗原位点，且能自动组装成vlps。优化修饰后的氨基酸序列为seqidno:4；编码基因进行了密码子优化，消除基因稀有密码子，从而能够更好在杆状病毒表达系统中表达vp2蛋白；优化后的基因的核苷酸序列为seqidno:3。
实施例2、表达vp2基因的杆粒的构建
2.1酶切反应
2.1.1标记好需要用到的1.5mlep管，在1.5mlep管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μl，加样如下表所示：
2.1.2将步骤2.2.1中的1.5mlep管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。
2.1.3双酶切产物胶回收
取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的dna片段。
(1)标记好样品收集ep管、吸附柱以及收集管。
(2)称取标记好的空的ep管重量，并记录数值。
(3)将单一的目的dna条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5ml离心管中。
(4)向步骤(3)中的1.5ml离心管中加入600μlpcbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(5)柱平衡：向吸附柱cb2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μl平衡液bl，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱cb2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb2放入收集管中。
(7)向吸附柱中加入600μl漂洗液pwbuffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中。
(8)重复步骤(7)。
(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。
(10)将吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlelutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱cb2，盖上离心管盖子，保留离心管中的dna样品。
(12)将步骤11中的dna样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收dna片段。
2.2连接反应
(1)标记需要用到的0.2ml离心管。
(2)在标记完整的0.2ml管中按照下表的20μl反应体系进行加样：
其中插入dna片段为优化后的序列为seqidno:3的核苷酸片段和未优化的seqidno:1的核苷酸片段。
(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。
(4)将0.2ml离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。
(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
2.3转化反应
(1)将10μl连接反应液快速加入100μl感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。
(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。
(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μl液体lb培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。
(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用lb抗性平板。
(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μl上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。
(7)观察记录转化结果。
2.4质粒抽提与pcr鉴定
2.4.1质粒抽提
(1)用10μl移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)吸取菌液至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。
(3)向步骤(2)中的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体。
(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中dna溶液。
2.4.2pcr鉴定
(1)标记好需要用到的pcr管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μl：
(2)pcr扩增程序：
(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序，确定阳性质粒。
2.5转化
将测序阳性的质粒转化dh10bac感受态细胞，方法同2.3.
2.6挑取杆粒与pcr鉴定
2.6.1挑取杆粒
(1)从2.5转化的平板中，用10μl移液枪头从转化平板中挑取白色单克隆菌落至5ml含卡那霉素抗性、四环素抗性、庆大霉素抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)吸取菌液至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。
(3)向步骤(2)中的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体。
(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。
(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中dna溶液。
2.6.2pcr鉴定将2.6.1中提取的dna，进行pcr鉴定，鉴定阳性的质粒送上海生物工程有限公司进行测序，测序阳性的用于sf9细胞转染。
实施例3sf9细胞转染
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；tnm-fh培养液置于27℃水浴锅预热至27℃。
(2)将2μg重组dna加入到100μl无血清和双抗的tnm-fh培养液中，混匀。将9μlcellfectinreagent加入到100μl无血清和双抗的tnm-fh培养液中，混匀。将脂质体与重组dna混合，室温静止40min。
(3)从27℃培养箱中取出6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的tnm-fh培养液洗细胞三次，并弃去tnm-fh培养液。
(4)每个细胞孔加入2ml10％胎牛血清的tnm-fh培养液。
(5)将重组dna与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6h。
(6)将孔中的液体弃掉，加入2ml完全tnm-fh培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静止培养5～6天。
(7)待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，标记为p1代重组杆状病毒，命名为fpv-vlp-p1。
(8)用fpv-vlp-p1感染新培养的sf9细胞，提高重组杆状病毒含量，反复接种2代后，收取细胞上清液，4℃或-80℃保存备用。
实施例4蛋白纯化与检测
4.1重组vp2蛋白在昆虫细胞sf9内的表达与鉴定：
将重组杆状病毒fpv-vlp-p1感染昆虫细胞sf9，27℃培养72h，同时以未感染病毒的正常昆虫细胞sf927℃培养48h作为对照，收获细胞，将培养上清冻存备用。细胞用ph7.4的pbs洗涤后，加入1×sds-page加样缓冲液[50mmtris-hcl(ph6.8)，100mmdithiothreitol(dtt),2％sds,0.05％bromophemolblue,10％glycerol]，煮沸5min，用12％分离胶、5％浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100伏约2.5h，考马斯亮蓝r250染色。
结果表明，未优化的vp2基因的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达量检测不到，而优化的vp2重组杆状病毒感染的昆虫细胞sf9裂解物中有vp2蛋白表达。
4.2重组vp2蛋白的层析纯化：
将重组杆状病毒fpv-vlp接种昆虫细胞sf9，27℃培养72小时后，离心收集细胞沉淀，细胞沉淀中加入适量生理盐水,重悬细胞沉淀，经超声波裂解细胞，以1000r/min4℃离心10min，收集上清液为，用ni2+柱进行层析纯化获得vp2蛋白的vlp蛋白液。
4.3westernblot：
将猫细小全病毒和4.2制备的蛋白同时进行sds-page，采用半干法20伏转印30min，将目的蛋白条带转移到pvdf膜，转印膜用封闭液封闭过夜，pbst洗涤3次，1∶500稀释的猫细小病毒阳性血清37℃作用1.5h，pbst洗3次，用1∶2000稀释的hrp标记的兔抗猫酶标抗体37℃作用1.5h，pbst洗涤3次，底物溶液作用5min，在chemidoc进行显色，结果全病毒条带很弱，而优化后的核苷酸序列为seqidno:3的基因在昆虫细胞sf9内表达的vp2蛋白条带很亮，说明优化后的vp2蛋白免疫原性更好。
4.4ha检测将4.2制备的蛋白用猪血清进行ha检测，结果fpv-vlp的血凝价分别为18log2，比全病毒均高11log2。说明表达的vp2蛋白免疫原性更好。
将筛选的猫细小病毒浓缩100倍。将浓缩的全病毒液和重组杆状病毒在sf9细胞中的表达产物同时进行负染后电镜观察。结果表达产物组装成很多病毒样颗粒，大小为20nm，而浓缩100倍的全病毒液只有微量的颗粒。
实施例5：疫苗的制备
(1)水相制备：将实施例2的步骤4.2纯化的vlp蛋白液与无菌生理盐水适当比例混合，水相中ha均不低于6log2；
(2)取水相15％体积的gel01佐剂与水相进行乳化，以1000r/min，乳化5分钟制成亚单位疫苗。
疫苗的安全性和效力检验
1)安全检验：
取健康易感猫(猫细小中和抗体均不高于1:4)20只，随机分为2组。一组为疫苗免疫组，每组10只，皮下注射5头份(5ml)的本发明的亚单位疫苗；另10只不免疫作对照。免疫后连续观察14日，记录体温、精神状态、食欲、粪便变化情况及注射局部是否有不良反应。于试验最后一日剖杀，检查注射部位有无病理变化。在观察期内，免疫组和对照组猫在体温、精神状态、食欲、粪便均正常，注射局部无肿胀和炎症等不良反应，注射部位剖检检查未出现异常变化，疫苗接种组猫生长情况与对照组差异不显著。上述结果表明制备的亚单位疫苗满足安全检测要求。
2)效力检验
取健康易感猫(猫细小中和抗体均不高于1:4)30只，随机分为3组，每组10只。一组免疫自制的亚单位疫苗，一组免疫市场猫细小疫苗，一组不免疫做对照。免后21天，采血检测hi。并同时进行猫细小病毒强毒攻击，口服8ml(106.5tcid50/ml)和腹腔注射2ml，即每只攻毒剂量为107.5tcid50。结果显示，亚单位免疫组的hi平均值为1:891.4，市场疫苗免疫组的hi平均值为1:111.4，而对照组hi均<2log2，说明猫细小亚单位疫苗能产生很好的抗体，且比市场疫苗滴度高很多。攻毒结果表明，亚单位疫苗免疫组10/10保护，市场疫苗免疫组8/10保护，而对照组10/10发病。说明猫细小亚单位疫苗能很好地抵御猫细小病毒强毒的攻击，保护效果好。详见表1。
表1猫细小亚单位疫苗的效力检验结果
注：抗体为该组猫的几何平均抗体值。
上述结果表明，病毒样颗粒制备的亚单位疫苗能很好地预防猫细小病毒的感染，且亚单位疫苗产生的抗体远高于市场疫苗组，所以具有良好的应用前景。
综上，本发明将未优化的vp2蛋白以及优化的vp2蛋白同时构建用于表达抗原蛋白的杆粒载体，结果未经优化的全长vp2基因不能在昆虫细胞中表达，而优化的vp2蛋白在昆虫细胞中成功地表达出可溶性的重组蛋白。将浓缩100倍的全病毒毒株、表达的vp2上清同时进行电镜观察，结果浓缩100倍的全病毒只有少量的vlp，而未经稀释表达的vp2上清在体内自动组装成病毒样颗粒(vlps)，且病毒粒子量很多。vlp在空间构想上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于vlp不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高。
序列表
<110>青岛易邦生物工程有限公司
<120>一种猫细小病毒vp2蛋白及制备的病毒样颗粒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1755
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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acaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatt120
tctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacgggtgggtggaa180
atcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattattct240
agagtagttgtaaataatgtggataaaactgcagttaaaggaaacatggctttagatgat300
actcatgtacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggggagtttgg360
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aaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaatacca660
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agaaaattatattaa1755
<210>2
<211>584
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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151015
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202530
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