一种检测NDRG4、SDC2和BMP3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒的制作方法

本发明属于医学基因检测
技术领域：
，尤其涉及一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒。
背景技术：
：结直肠癌(colorectalcancer,crc)是常见的恶性肿瘤之一，依据国际癌症研究组织2012年的统计，世界范围内结直肠癌发病率高居癌症谱第3位，新发病例约136万人。占所有癌症的10％：疾病导致死亡69万人，位居癌症死亡谱第2位。随着改革开放和现代化建设的逐步深化、城乡人口生活方式的日益西化。过去的10年我国结直肠癌发病率及病死率总体呈现逐步上升趋势。2013年我国结直肠癌发病率为17.2/10万、病死率为7.76/10万，较2008年的14.6/10万和6.18/10万均有明显上升。2018年2月国家癌症中心全国癌症最新数据显示，结直肠癌在全国发病率中排第3位，死亡率排第5位。结直肠癌发病隐匿，但多依据经典的腺瘤—不典型增生，腺癌模式进展。从良性息肉发展为进展期肿瘤通常需要5～15年。结直肠癌预后与临床病理学分期密切相关。早期结直肠癌的5年生存率高达90％，而晚期结直肠癌不足10％。正因为结直肠癌具有起病隐匿、病程长和早期诊断预后好的特点，使得筛查在结直肠癌总体防控中有着举足轻重的地位。为减轻个人和社会的疾病负担，各国对结直肠癌筛查项目的投入逐年增加。目前结直肠癌常规检测的主要方法有便潜血检测(fobt)和粪便免疫化学法(fit)，但是该方法的灵敏度低，对进展期息肉的灵敏度仅为20～25％。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒，采用本发明提供的引物探针组合，提高了检测人结直肠癌的灵敏度。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合，所述引物探针包括检测目标基因甲基化引物探针和β-actin引物探针；检测ndrg4基因甲基化的引物的序列如seqidno.1～2所示，检测ndrg4基因甲基化的探针的序列如seqidno.3所示；检测sdc2基因甲基化的引物的序列如seqidno.4～5所示，检测sdc2基因甲基化的探针的序列如seqidno.6所示；检测bmp3基因甲基化的引物的序列如seqidno.7～8所示，检测bmp3基因甲基化的探针的序列如seqidno.9所示；β-actin引物的序列如seqidno.10～11所示，β-actin探针的序列如seqidno.12所示。优选的，在所述检测目标基因甲基化的探针的5`端添加fam标记，在3`端添加mgb标记。优选的，在所述β-actin探针的5`端添加vic标记，在3`端添加mgb标记。本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在制备检测人结直肠癌试剂盒中的应用。本发明还提供了一种试剂盒，包括ndrg4反应液、sdc2反应液和bmp3反应液；所述ndrg4反应液包括无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、上述技术方案所述的检测ndrg4基因甲基化的引物、上述技术方案所述的检测ndrg4基因甲基化的探针、上述技术方案所述的β-actin引物和上述技术方案所述的β-actin探针；所述sdc2反应液包括无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、上述技术方案所述的检测sdc2基因甲基化的引物、上述技术方案所述的检测sdc2基因甲基化的探针、上述技术方案所述的β-actin引物和上述技术方案所述的β-actin探针；所述bmp3反应液包括无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、上述技术方案所述的检测bmp3基因甲基化的引物、上述技术方案所述的检测bmp3基因甲基化的探针、上述技术方案所述的β-actin引物和上述技术方案所述的β-actin探针。优选的，所述ndrg4反应液中，10×pcrbuffer的浓度为1×pcrbuffer，dntp的浓度为0.25mm，检测sdc2基因甲基化的引物的浓度分别为0.4um，检测ndrg4基因甲基化的探针的浓度为0.4um，β-actin引物的浓度分别为0.4um，β-actin探针的浓度为0.4um。优选的，所述sdc2反应液中，10×pcrbuffer的浓度为1×pcrbuffer，dntp的浓度为0.25mm，检测sdc2基因甲基化的引物的浓度分别为0.3um，检测sdc2基因甲基化的探针的浓度为0.3um，β-actin引物的浓度分别为0.4um，β-actin探针的浓度为0.4um。优选的，所述bmp3反应液中，10×pcrbuffer的浓度为1×pcrbuffer，dntp的浓度为0.25mm，检测bmp3基因甲基化的引物的浓度分别为0.4um，检测bmp3基因甲基化的探针的浓度为0.4um，β-actin引物的浓度分别为0.4um，β-actin探针的浓度为0.4um。优选的，所述试剂盒还包括：taq酶、阳性对照和阴性对照。优选的，所述阳性对照为结直肠癌细胞株，所述阴性对照为人外周血基因组dna。本发明提供了一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒，ndrg4、sdc2和bmp3基因的启动子的甲基化与结直肠癌的发生和发展密切相关，是结直肠癌特异的分子标记，通过检测人粪便中ndrg4、sdc2和bmp3基因的启动子的甲基化来检测结直肠癌。本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合提高了对结直肠癌的灵敏度，灵敏度为88.1％，在结直肠癌早期就能够检测出，无侵入性，便捷。附图说明图1为ndrg4甲基化阳性样本结果图；图2为甲基化阴性样本结果图；图3为未进行亚硫酸盐转化的人类基因组样本结果图；图4为sdc2甲基化阳性样本结果图；图5甲基化阴性样本结果图；图6为未进行亚硫酸盐转化的人类基因组样本结果图；图7为bmp3甲基化阳性样本结果图；图8为甲基化阴性样本结果图；图9为未进行亚硫酸盐转化的人类基因组样本结果图。具体实施方式本发明提供了一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合，所述引物探针包括检测目标基因甲基化引物探针和β-actin引物探针；检测ndrg4基因甲基化的引物的序列如seqidno.1～2所示，检测ndrg4基因甲基化的探针的序列如seqidno.3所示；检测sdc2基因甲基化的引物的序列如seqidno.4～5所示，检测sdc2基因甲基化的探针的序列如seqidno.6所示；检测bmp3基因甲基化的引物的序列如seqidno.7～8所示，检测bmp3基因甲基化的探针的序列如seqidno.9所示；所述β-actin引物的序列如seqidno.10～11所示，所述β-actin探针的序列如seqidno.12所示。在本发明中，所述ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针是根据ndrg4、sdc2和bmp3基因的启动子区设计的。在本发明中，所述检测ndrg4基因甲基化的引物包括检测ndrg4基因甲基化的上游引物和下游引物，所述上游引物的的序列如seqidno.1所示，具体如下所示：5`-ggtttttggttgttcgtatttgt-3`；所述下游引物的序列如seqidno.2所示，具体如下所示：5`-gaaaatacgaacgaaacaaacgc-3`；所述检测ndrg4基因甲基化的探针的序列如seqidno.3所示，具体如下所示：5`-aaacgaaacttcgacgcc-3`。本发明优选在检测ndrg4基因甲基化的探针的5`端添加fam标记，在3`端添加mgb标记。在本发明中，所述检测sdc2基因甲基化的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的的序列如seqidno.4所示，具体如下：5`-aagcgagcgttttcgagtttc-3`；所述下游引物的序列如seqidno.5所示，具体如下：5`-cacacgaatccgaaacaaaatac-3`；所述检测sdc2基因甲基化的探针的序列如seqidno.6所示，具体如下：5`-aacgattacgactcaaac-3`。本发明优选在检测sdc2基因甲基化的探针的5`端添加fam标记，在3`端添加mgb标记。在本发明中，所述检测bmp3基因甲基化的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如seqidno.7所示，具体如下：5`-actccaaaccaactaaaacgaaaac-3`；所述下游引物如seqidno.8所示，具体如下：5`-gtcgttatttcgttgtattcggtc-3`；所述检测bmp3基因甲基化的探针的序列如seqidno.9所示，具体如下所示：5`-cacgaaacccgaaac-3`。本发明优选在所述检测bmp3基因甲基化的探针的5`端添加fam标记，在3`端添加mgb标记。在本发明中，所述β-actin引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如seqidno.10所示，具体如下：5`-ggttaggaaggaggttgtttgtttt-3`；所述下游引物的序列如seqidno.11所示，具体如下所示：5`-atcatctttcccaccaaactataacc-3`；所述β-actin探针的序列如seqidno.12所示，具体如下所示：5`-cccattaactaaacacaacct-3`。本发明优选在β-actin探针的5`端添加vic标记，在3`端添加mgb标记。本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在制备检测人结直肠癌试剂盒中的应用。本发明还提供了一种试剂盒，包括ndrg4反应液、sdc2反应液和bmp3反应液；所述ndrg4反应液包括无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、检测ndrg4基因甲基化的引物、检测ndrg4基因甲基化的探针、β-actin引物和β-actin探针；所述sdc2反应液包括无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、检测sdc2基因甲基化的引物、检测sdc2基因甲基化的探针、β-actin引物和β-actin探针；所述bmp3反应液包括无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、检测bmp3基因甲基化的引物、检测bmp3基因甲基化的探针、β-actin引物和β-actin探针。在本发明中，所述ndrg4反应液中，10×pcrbuffer的浓度优选为1×pcrbuffer，dntp的浓度优选为0.25mm，检测sdc2基因甲基化的引物的浓度分别优选为0.4um，检测ndrg4基因甲基化的探针的浓度优选为0.4um，β-actin引物的浓度分别优选为0.4um，β-actin探针的浓度优选为0.4um。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述ndrg4反应液在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规试剂盒放置反应液的量即可。在本发明中，所述sdc2反应液中，10×pcrbuffer的浓度优选为1×pcrbuffer，dntp的浓度优选为0.25mm，检测sdc2基因甲基化的引物的浓度分别优选为0.3um，检测sdc2基因甲基化的探针的浓度优选为0.3um，β-actin引物的浓度分别优选为0.4um，β-actin探针的浓度优选为0.4um。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述sdc2反应液在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规试剂盒放置反应液的量即可。在本发明中，所述bmp3反应液中，10×pcrbuffer的浓度优选为1×pcrbuffer，dntp的浓度优选为0.25mm，检测bmp3基因甲基化的引物的浓度分别优选为0.4um，检测bmp3基因甲基化的探针的浓度优选为0.4um，β-actin引物的浓度分别优选为0.4um，β-actin探针的浓度优选为0.4um。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述bmp3反应液在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规试剂盒放置反应液的量即可。在本发明中，所述试剂盒优选还包括：taq酶、阳性对照和阴性对照。在本发明中，所述阳性对照优选为结直肠癌细胞株，所述阴性对照优选为人外周血基因组dna。在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：1)提取人粪便基因组dna，将所述人粪便基因组dna进行亚硫酸盐转化处理，得到处理dna；2)将所述步骤1)得到的处理dna分别与上述技术方案所述的ndrg4反应液、sdc2反应液、bmp3反应液混合后，再分别与taq酶混合后进行实时荧光pcr扩增，得到扩增结果；3)当所述步骤2)扩增结果β-actin≤35，ndrg4、sdc2和bmp3任一基因的ct≦38时，人粪便中的ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化为阳性，当所述扩增结果β-actin≤35，ndrg4、sdc2和bmp3任一基因的ct＞38时，人粪便中的ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化为阴性，当所述扩增结果β-actin＞35，样本量不足或有抑制物存在，实时荧光pcr扩增反应无效。在本发明中，所述人粪便基因组dna的提取方法优选包括以下步骤：a、将人粪便离心后，将得到的第一上清液与抽提液a混合后，在70℃下温育5min，再4000g离心5min，得到第二上清液；b、将得到的第二上清液与蛋白酶k溶液、抽提液b混合后在65℃下孵育15min，再4000g离心10min，得到第三上清液；c、将得到的第三上清液95℃孵育5min，在室温条件下温度降到65℃与含有捕获探针的磁珠溶液混合，放置1h，弃去上清液后依次用洗液a、洗液b和洗液c各进行2次清洗磁珠，将得到的清洗磁珠用洗脱液进行洗脱，得到的溶液中含有人粪便基因组dna。在本发明中，所述第一上清液与抽提液a的体积比优选为1:1。在本发明中，所述抽提液a中优选含有质量百分含量为1～2的sds、0.05～0.1m的tris和20mm的edta。在本发明中，所述第二上清液与蛋白酶k溶液、抽提液b的体积比优选为5ml:30ul:5ml。在本发明中，所述蛋白酶k的浓度优选为20mg/ml。在本发明中，所述抽提液b中优选含有4～5m的异硫氰酸胍、20～40mm的柠檬酸钠、体积分数为0.5～1％的吐温20和质量分数为1‰的二硫代苏糖醇。在本发明中，所述第三上清液与含有捕获探针的磁珠溶液的体积比优选为10ml:40ul。在本发明中，所述含有捕获探针的磁珠溶液中磁珠的浓度优选为10mg/ml，所述磁珠上优选包含有捕获探针，每毫克磁珠上的捕获探针的量优选为500pmol。在本发明中，所述捕获探针包括ndrg4探针、sdc2探针、bmp3探针和β-actin探针，4种探针等比混合。在本发明中，所述ndrg4探针的序列如seqidno.13所示，具体如下：5`-gagatgcggacgagacagacgcgcaggcg3'。本发明优选在ndrg4探针的5`进行biotin-teg标记。在本发明中，所述sdc2探针的序列如seqidno.14所示，具体如下：5`agcccgcgcacacgaatccggagcagagtaccg3'。本发明优选在sdc2探针的5`进行biotin-teg标记。在本发明中，所述所述bmp3探针的序列如seqidno.15所示，具体如下：5`cgggtgcagcgagatagcggccagcc3'。本发明优选在bmp3探针的5`进行biotin-teg标记。在本发明中，所述所述β-actin探针的序列如seqidno.16所示，具体如下：5`tgtgaacctgtgtctgccactgtgtgctgg3'。本发明优选在β-actin探针的5`进行biotin-teg标记。在本发明中，所述洗液a中优选含有5～7m盐酸胍、质量百分含量为1～5％的peg、0.1～0.3m无水乙酸钠和体积浓度为4‰的冰醋酸。在本发明中，所述洗液b中优选含有0.2～0.6m的盐酸胍、质量百分含量为1～4％的ctab、体积分数为75％的乙醇和20mm的edta，在本发明中，所述洗液c优选为乙醇溶液，乙醇的体积分数优选为70～80％。在本发明中，所述洗脱液优选为te缓冲液，所述te缓冲液中含有10mm的tris-hcl和1mm的edta，所述te缓冲液的ph值优选为8.0。在本发明中，所述人粪便基因组dna进行亚硫酸盐转化处理的方法优选包括：将所述人粪便基因组dna与无核酸酶水、转化反应液混合后进行转化。在本发明中，所述人粪便基因组dna溶液与无核酸酶水、转化反应液的体积比优选为(1～20):(0～19):(130)。在本发明中，所述转化反应液的配制方法优选包括：取1管solution1，加入300ulsolution2和790ulsolution3，充分震荡混匀8～10min至晶体完全溶解；加入160ulsolution4，震荡混匀，得到转化反应液。在本发明中，所述solution1、solution2、solution3和solution4来源于转化试剂盒，具体来源于ezdnamethylationtmkits。在本发明中，所述转化的条件包括：98℃反应8min，64℃反应3.5h，20℃最多反应20h。在本发明中，所述实时荧光pcr反应的体系，每20ul包括ndrg4反应液、sdc2反应液或bmp3反应液18.3ul，taq酶0.2ul，处理dna1.5ul。在本发明中，所述实时荧光pcr反应的程序为：95℃5min；95℃15s，60℃30s(采集荧光)，50个循环。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1一种用于人结直肠癌检测的特异性引物设计人结直肠癌特异性甲基化的pcr引物与探针，是根据ncbi(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列，使用primerpremier3.0及methylprimerpressv1.0设计，见表1，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。表1引物探针ndrg4-mf5`-ggtttttggttgttcgtatttgt-3`seqidno.1ndrg4-mr5`-gaaaatacgaacgaaacaaacgc-3`seqidno.2ndrg4-mp5`-fam-aaacgaaacttcgacgcc-3`mgbseqidno.3sdc2-mf5`-aagcgagcgttttcgagtttc-3`seqidno.4sdc2-mr5`-cacacgaatccgaaacaaaatac-3`seqidno.5sdc2-mp5`-fam-aacgattacgactcaaac-3`mgbseqidno.6bmp3-mf5`-actccaaaccaactaaaacgaaaac-3`seqidno.7bmp3-mr5`-gtcgttatttcgttgtattcggtc-3`seqidno.8bmp3-mp5`-fam-cacgaaacccgaaac-3`mgbseqidno.9β-actin-mf5`-ggttaggaaggaggttgtttgtttt-3`seqidno.10β-actin-mr5`-atcatctttcccaccaaactataacc-3`seqidno.11β-actin-mp5`-vic-cccattaactaaacacaacct-3`mgbseqidno.12其中检测目标基因探针5’端采用fam标记作为发光基团、β-actin-mp探针5’端采用vic标记作为发光基团，3’端均使用mgb作为淬灭基团。实施例2一种用于人粪便脱落细胞dna提取的试剂盒人粪便脱落细胞dna提取的试剂包括：样本保存液：licl(2-6m)、edta(0.05-0.2m)、tris(0.1-0.3m)、tcep.hcl(50mm)、pvpp(5％)抽提液a：含sds(1-2％)、tris(0.05-0.1m)、edta(20mm)的溶液；抽提液b：含异硫氰酸胍(4-5m)、柠檬酸钠(20-40mm)、吐温20(0.5-1％)、二硫代苏糖醇(1‰)的溶液；蛋白酶k：20mg/ml；生物素标记磁珠：10mg/ml，其中包含捕获探针(～500pmol生物素探针/mg磁珠)，捕获探针序列如表2，捕获探针5端采用生物素标记：表2捕获探针ndrg4-bio5`biotin-teggagatgcggacgagacagacgcgcaggcg3'seqidno.13sdc2-bio5`biotin-tegagcccgcgcacacgaatccggagcagagtaccg3'seqidno.14bmp3-bio5`biotin-tegcgggtgcagcgagatagcggccagcc3'seqidno.15β-actin-bio5`biotin-tegtgtgaacctgtgtctgccactgtgtgctgg3'seqidno.16洗液a：含盐酸胍(5-7m)、peg(1-5％)、无水乙酸钠(0.1-0.3m)、冰醋酸(4‰)；洗液b：含盐酸胍(0.2-0.6m)、ctab(1-4％)、乙醇(75％)、edta(20mm)；洗液c：含乙醇(70-80％)；洗脱液：te缓冲液(10mmtris-hcl、1mmedta、ph＝8.0)。实施例3一种用于人结直肠癌甲基化检测的试剂盒，包括：ndrg4反应液包括：无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、ndrg4-mf、ndrg4-mr、ndrg4–mp、β-actin-f、β-actin-r、β-actin-mp。各种物质的终浓度pcrbuffer(1×)、dntp(0.25mm)、ndrg4-mf(0.4um)、ndrg4-mr(0.4um)、ndrg4-mp(0.4um)、、β-actin-f(0.4um)、β-actin-r(0.4um)、β-actin-mp(0.4um)。sdc2反应液包括：无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、sdc2-mf、sdc2-mr、sdc2-mp、β-actin-f、β-actin-r、β-actin-mp。各种物质的终浓度pcrbuffer(1×)、dntp(0.25mm)、sdc2-mf(0.3um)、sdc2-mr(0.3um)、sdc2-mp(0.3um)、β-actin-f(0.4um)、β-actin-r(0.4um)、β-actin-mp(0.4um)。bmp3反应液包括：无核酸酶水、10×pcrbuffer、dntp、bmp3-mf、bmp3-mr、bmp3-mp、β-actin-f、β-actin-r、β-actin-mp。各种物质的终浓度pcrbuffer(1×)、dntp(0.25mm)、bmp3-mf(0.4um)、bmp3-mr(0.4um)、bmp3-mp(0.4um)、β-actin-f(0.4um)、β-actin-r(0.4um)、β-actin-mp(0.4um)。hstaq酶，甲基化标准品dna和非甲基化标准品dna。实施例4实施例2～3的试剂盒在诊断人结直肠癌中的应用本发明采用的无核酸酶水、10×pcrbuffer、hstaq酶、dntps购自于宝生物(大连)有限公司；转化试剂盒ezdnamethylationtmkits，购自于zymoresearch。阳性对照(结直肠癌细胞株)，阴性对照(健康人外周血基因组dna)。本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。方法：一、生物样本：为2018年10-2019年3月期间在湘雅医院就诊的直肠腺瘤90例、结直肠息肉104例、结直肠炎症139例、280例肠道正常人群样本，结直肠癌病例361例粪便样本。二、dna提取：取样本10ml，混匀离心后取上清5ml。加入5ml抽提液a，70℃温育5min，然后4000g离心5min；取5ml上清加入新的离心管中；新的离心管中加入30ulpk，5ml抽提b液；混匀65℃孵育15min；孵育完毕后放入离心机中离心10min，取上清转移到新的离心管；95℃孵育5min；加入带捕获探针的磁珠30ul，混匀后室温放置1h；杂交完毕后吸磁去上清；洗液a、洗液b、洗液c按顺序各清洗2遍；加入40ul洗脱液在65℃下进行洗脱。dna溶液2-8℃保存，若需长期保存则置于-20℃或更低温度。三、dna转化的流程将提取的dna配置亚硫酸盐转化体系配置：将提取的dna配置转化体系配置：(转化反应液配制：取1管solution1，加入300ulsolution2和790ulsolution3，充分震荡混匀8-10min至晶体完全溶解；加入160ulsolution4，震荡混匀，待用；未用完的转化反应液请于2-8℃保存，保存不超过1个月)表3亚硫酸盐转化体系成分反应体积(μl)提取的待转化dna1-20μl(200ng～2ug)rnase-freewater补足20μl转化反应液130ul总计150μl1.亚硫酸盐转化运行：表4亚硫酸盐转化条件反应温度反应时间98℃8min64℃3.5h20℃≤20h2.亚硫酸盐转化后dna纯化：1)取纯化柱加入600ulbuffera，再将转化产物转移至纯化柱中，颠倒混匀数次；2)10000rpm离心30s，弃流出液；3)加100μlbufferb，10000rpm离心30s，弃流出液；4)加入200ulbufferc，室温静置15min，10000rpm离心30s，弃流出液；5)加200μlbufferb，10000rpm离心30s，弃流出液；6)重复步骤5；7)10000rpm空转离心2min；8)将纯化柱插入到一新的ep管中，加入20ulelutionbuffer，室温静置1min；9)10000rpm离心1min收集流出液即为已转化的dna溶液，保存于-20℃。所述buffera、b和elutionbuffer来源于转化试剂盒，具体来源于ezdnamethylationtmkits。四、pcr流程1、使用的pcr仪器为abi7500，反应体系为20ul；2、pcr反应体系配制及条件见如下表5和表6所示：表5pcr反应体系的配制成分反应体积(ul)pcr反应液17.3ultaq酶0.2ul亚硫酸盐转化后的dna模板2.5ul表6pcr反应程序五、结果分析试剂盒检测结果满足质控要求，根据检测结果对样本进行判断。β-actin≤35，样本检测结果为任1个基因ct≦38，则判定样本为甲基化阳性；β-actin≤35，样本检测结果为ndrg4、sdc2和bmp3均ct＞38；则判样本为甲基化阴性，β-actin＞35，则样本不足或有抑制物存在pcr反应无效，需重复实验或采样。表7荧光pcr结果判读六、结直肠癌ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化在阴性样本中(90例直肠腺瘤、104例结直肠息肉、139例结直肠炎症、280例肠道正常人群样本)检出率为7.35％阳性，361例结直肠粪便样本中检出率为88.1％。与正常组相比p<0.001，ndrg4、sdc2和bmp3基因的甲基化比例具有显著差异。表8粪便脱落细胞的ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化检测统计结果灵敏度＝a/(a+b)×100％＝318/(318+43)＝88.1％特异性＝d/(c+d)×100％＝731/(731+58)＝92.6％总符合率：(a+d)/(a+b+c+d)×100％＝(318+731)/1150＝91.2％表9结直肠癌各阶段检出率实施例5采用实施例4相同的实验方法检测ndrg4不同甲基化阳性比例样本，结果见图1～3；未进行亚硫酸盐转化的dna是为了证明人未进行亚硫酸盐转化的基因组dna不会对结果有所干扰。采用实施例4相同的实验方法检测sdc2不同甲基化阳性比例样本，结果见图4-6；未进行亚硫酸盐转化的dna是为了证明人未进行亚硫酸盐转化的基因组dna不会对结果有所干扰。采用实施例4相同的实验方法检测bmp3不同甲基化阳性比例样本，结果见图7-9；未进行亚硫酸盐转化的dna是为了证明人未进行亚硫酸盐转化的基因组dna不会对结果有所干扰。由以上实施例可以得出，采用本发明提供的检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合提高了对结直肠癌的灵敏度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>湖南百伯基因技术有限公司<120>一种检测ndrg4、sdc2和bmp3基因甲基化的引物探针组合及其应用和试剂盒<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggtttttggttgttcgtatttgt23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaaaatacgaacgaaacaaacgc23<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aaacgaaacttcgacgcc18<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aagcgagcgttttcgagtttc21<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cacacgaatccgaaacaaaatac23<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aacgattacgactcaaac18<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7actccaaaccaactaaaacgaaaac25<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtcgttatttcgttgtattcggtc24<210>9<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cacgaaacccgaaac15<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggttaggaaggaggttgtttgtttt25<210>11<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11atcatctttcccaccaaactataacc26<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cccattaactaaacacaacct21<210>13<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gagatgcggacgagacagacgcgcaggcg29<210>14<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14agcccgcgcacacgaatccggagcagagtaccg33<210>15<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cgggtgcagcgagatagcggccagcc26<210>16<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tgtgaacctgtgtctgccactgtgtgctgg30当前第1页12