一种虾夷扇贝二肽、其虚拟筛选方法及其复合凝胶的制备方法与流程

本发明涉及海洋资源开发利用加工技术领域，更具体地说，涉及一种虾夷扇贝二肽、其虚拟筛选方法及其复合凝胶的制备方法。

背景技术：

食品体系是一个多成分复杂的体系，蛋白质和多糖是其中重要的两大类天然的高分子聚合物。蛋白质具有两亲独特的结构和表面活性，但是在工业生产应用中具有一定的局限性，因为蛋白质遇热会变性，变性导致随机的聚合而产生凝结，使得食品的稳定性下降，进而影响食品品质与货架期，通常情况下，添加食品胶可以很好的解决这一问题。作为食品添加剂，食品胶具有凝胶、保水、增稠、促进乳化稳定等优良特性，主要来源于藻类、植物、动物和微生物中，化学组成大都为天然多糖、蛋白质及衍生物，广泛分布于自然界。近些年来，多糖与蛋白质的研究不断深入，并引入了新的流变学和微观结构等分析手段对蛋白质-多糖复合物的反应机理、结构、功能特性等展开了卓有成效的研列。

扇贝是一种经济和营养价值均较高的海珍品，味道鲜美，富含多种营养素。我国进行扇贝的人工养殖始于1968年，随着增养殖技术的不断进步，扇贝养殖规模不断扩大，产量逐年递增，已成为我国沿海水产养殖的重点经济贝类品种，其养殖已取得了明显的经济效益。2017年，我国扇贝养殖产量高达201万吨。随着扇贝养殖规模的扩大和产量的提高，扇贝加工制品的需求也随之上升。虾夷扇贝雄性生殖腺中的蛋白质含量可达其干基的87％左右，可以作为蛋白质摄入来源之一，这个发现对于扇贝生殖腺功能的开发具有重要的社会和经济价值；另外，其必需氨基酸的含量也非常丰富，约占整个氨基酸含量的42％，是开发活性功能肽的良好来源。

卡拉胶(carrageenan)也称作角叉菜胶，属亲水性凝胶多糖。其是由1，3-苷键连接β-d-半乳糖吡喃基和1，4-苷键连接的α-d-半乳糖吡喃基为基本单位的线型聚糖。根据半乳糖中是否含有内醚和半乳糖上硫酸酯基团的数量及连接位置，卡拉胶可分为κ-、μ-、ι-、θ-、λ-、ε-、ν-七种类型。最为常见和产量最高的卡拉胶是κ-、ι-和λ-型。其中，ι-硫酸酯基含量较高，在溶液中为无规则线团，形成的凝胶是透明的和富有弹性的。

同时，虾夷扇贝蛋白质经酶解后具有促凝胶形成现象，酶解程度与产物肽的生成量对其凝胶强度有正向调节作用，说明虾夷扇贝酶解物是以肽分子为主体的凝胶体系。而卡拉胶作为一种典型有效的促凝胶因子，与虾夷扇贝酶解物之间有协同作用，形成凝胶。然而制备酶解物的过程较为繁琐，获得的肽的纯度较低，决定其凝胶化行为的关键肽分子还亟待于进一步的研究。

近年来，随着生物信息学技术的不断发展，模拟(insilico)分析已广泛应用于活性肽分子的鉴定中。其省略传统天然产物提取过程中的纯化等步骤，极大提高了发现新肽的效率，使肽分子研究由精细的分解研究转向系统的整体研究成为可能。模拟(insilico)分析手段的应用前提有两点，一方面要有已知的蛋白质序列，另一方面所选工具蛋白酶要有明确的酶切位点。目前，虾夷扇贝基因组序列已经公开，通过nano-lc-ms/ms手段即可获得蛋白序列信息；而胰蛋白酶是生物信息学软件中常用的工具酶，具有明确的酶切位点。

技术实现要素：

本发明的目的在于开发一种利用insilico技术获得雄性虾夷扇贝复合凝胶肽的方法。根据虾夷扇贝基因组序列和肽形成凝胶化的驱动力，开发一种能获得凝胶肽的计算机在线模拟方法，并与ι-卡拉胶作用形成复合凝胶，省略传统天然产物提取过程中的纯化等步骤，极大提高了发现新肽的效率，提高混合胶体的营养价值，克服现有胶体营养单一的不足。

为了达到上述目的，本发明提供了一种虾夷扇贝二肽，由m、k2个氨基酸残基组成，分子量为277.38da，其氨基酸序列如seqid:1所示；所述虾夷扇贝二肽来源于雄性虾夷扇贝生殖腺。

所述虾夷扇贝二肽的模拟筛选方法，包括步骤：

s1、原料预处理：取雄性虾夷扇贝生殖腺，匀浆至无颗粒状，得匀浆液；

s2、sds-page分析：取步骤s1所述匀浆液进行sds-page电泳；

s3、蛋白质质谱鉴定：将步骤s2所得sds-page胶上清晰的单一蛋白条带切下，得虾夷扇贝蛋白，进行蛋白质质谱鉴定；

s4、蛋白质序列筛选：根据步骤s3蛋白质质谱鉴定结果，筛选出种属为虾夷扇贝、分子量分别在47.97kda～67.97kda、6.99kda～26.99kda、5.46kda～25.46kda、4.07kda～24.07kda范围之间的蛋白质序列；

s5、insilico分析：将步骤s4筛选后的获得的蛋白质序列，利用biopep在线工具(www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)，选择胰蛋白酶(trypsin)为参数进行模拟酶解，获得产物肽；

s6、目标肽的筛选：筛选等电点pi>7.0，在ph7.0时带正电荷以及溶解性好的阳离子肽，获得目标肽序列，所述目标肽的氨基酸序列如seqid:1所示；

s7、合成肽：将步骤s6获得的目标肽序列进行化学法中的固相法进行肽合成，所述肽的纯度在90％以上，得虾夷扇贝二肽。

优选方式下，步骤s1所述匀浆具体为：2000～4000rpm、10～15min。

优选方式下，步骤s2所述sds-page分析具体为：取步骤s1所述匀浆液与上样缓冲液等体积混合，100℃加热5～10min，25℃、200～500rpm震荡10～14h，10000g离心5～10min，取上清液；取所述上清液用上样缓冲液分别稀释2倍、4倍、8倍，所得稀释后的样品10μl进行sds-page检测；所述sds-page检测使用10％分离胶与5％浓缩胶，浓缩胶电流8ma，分离胶电流15ma，电泳完毕后，用0.05％考马斯亮蓝r-250过夜染色，用9％冰乙酸和50％乙醇溶液脱色；

其中，所述上样缓冲液包括组分：950μla液，50μlβ-巯基乙醇；所述a液包括组分：1.25mltris-hcl(ph6.8，0.5m)，2.5ml甘油，2ml质量分数w/v10％sds；

所述虾夷扇贝二肽可以用于制备复合凝胶；一种虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶的制备方法，包括步骤：

s1、制备ι-卡拉胶水溶液：将ι-卡拉胶加水溶解，制备成浓度为12～15mg/ml的卡拉胶水溶液；

s2、制备复合凝胶：将虾夷扇贝二肽加入到步骤s1制得的ι-卡拉胶水溶液中，混匀，得虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶；所述虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶中虾夷扇贝二肽的浓度为0.1～0.3mol/l；其中，所述虾夷扇贝二肽的氨基酸序列如seqid:1所示；

s3、排气泡：将步骤s2制备的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶排除气泡，制得终产物。

优选方式下，步骤s1所述溶解的温度为60～70℃。

优选方式下，步骤s3所述排气泡的方法为：将步骤s2所述复合凝胶2500～5000rpm离心5～10min除去混合液中的气泡；4～7℃放置8～16h，得到终产物。

本发明的有益效果是：

1、生殖腺为虾夷扇贝加工生产过程中的副产物，虽可食用，但利用率较低，本发明提高了虾夷扇贝生殖腺的利用率，使其蛋白质的组分得到充分开发利用，采用本方法制备的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶混合凝胶，可作为营养型凝胶制剂应用于多种食品中。

2、本发明方法选用的模拟(insilico)分析技术已广泛应用于活性肽分子的鉴定中。其省略传统天然产物提取过程中的纯化等步骤，极大提高了发现新肽的效率。

3、本发明方法中，制得的虾夷扇贝二肽，经与ι-卡拉胶混合后，凝胶性显著增强。

4、本发明提升了雄性虾夷扇贝二肽的凝胶特性，由于雄性虾夷扇贝生殖腺含有的蛋白质经insilico模拟酶解后产生大量的小分子肽，更易于人体吸收，使产品具有营养性。另外，混合胶体具有独特的食品功能性——凝胶特性，在食品加工生产中可以作为新型的凝胶剂添加到食品中，用来提高产品的凝胶性和营养性。

5、本发明涉及的操作过程简单，不需要复杂的设备，提升雄性虾夷扇贝二肽凝胶特性的效果较好。

本发明方法利用insilico胰蛋白酶模拟酶解虾夷扇贝生殖腺，通过肽序列的筛选、与卡拉胶溶液混合的方法，有效的提高了虾夷扇贝二肽的凝胶特性，且具有方法简单，效果好的特点。

附图说明

图1为本发明实施例制备的虾夷扇贝生殖腺sds-page分析图；hm：highmarker，lm：lowmarker；

图2为本发明实施例1虾夷扇贝生殖腺经insilico获得的正负电荷肽的数量分布；

图3为本发明实施例1虾夷扇贝生殖腺经insilico获得的正电荷肽中不同溶解性肽的数量分布；

图4为本发明实施例1虾夷扇贝生殖腺经insilico获得的溶解性好的阳离子肽的分子量分布；

图5为本发明实施例3制备的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶的频率扫描模式流变特性；

图6是本发明实施例2制备的精氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图7是本发明实施例2制备的赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图8是本发明实施例3制备的tk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图9是本发明实施例3制备的wk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图10是本发明实施例3制备的lk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图11是本发明实施例3制备的gk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图12是本发明实施例3制备的vk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图13是本发明实施例3制备的ck/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图14是本发明实施例3制备的nk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图15是本发明实施例3制备的fk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图16是本发明实施例3制备的mk/ι-卡拉胶复合凝胶的实物图；

图17是本发明对比例1制备的ι-卡拉胶水溶液的实物图。

具体实施方式

下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为达到上述目的，本发明提供了一种基于insilico获得虾夷扇贝复合凝胶肽的方法，包括如下步骤：

1、一种基于insilico获得虾夷扇贝复合凝胶肽的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：对雄性虾夷扇贝生殖腺从完整扇贝中取出，匀浆。

s2、sds-page分析：对雄性虾夷扇贝生殖腺匀浆液进行预处理，将预处理后的样品注入样品孔，通过一定电流进行sds-page分析，取下胶并染色脱色；

s3、切胶：将步骤s2制得的胶上清晰的条带切下，进行蛋白质质谱鉴定；

s4、蛋白质序列筛选：将步骤s3鉴定后的蛋白质序列，根据种属、蛋白质名称以及分子量进行筛选；

s5、insilico分析：将步骤s4筛选后的获得的蛋白质序列，利用biopep在线工具进行模拟酶解；

s6、目标肽的筛选：将步骤s5获得的产物肽根据等电点、静电荷及溶解性筛选，获得目标肽序列；

s7、合成肽：将步骤s6获得的目标肽序列进行肽合成。

s8、制备ι-卡拉胶水溶液：将ι-卡拉胶加水制备成溶液；

s9、制备复合凝胶：将步骤s7中合成肽粉末分别加入步骤s8制得的ι-卡拉胶水溶液中，混匀，得虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶；

s10、排气泡：将步骤s9制备的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶排除气泡，制得终产物。

优选方式下，步骤s2所述sds-page分析具体为：10％分离胶与5％浓缩胶混合；取步骤s1制得的雄性虾夷扇贝匀浆液与上样缓冲液等体积混合，样品煮沸5～10min后，在室温下过夜摇匀，离心5～10min(10000×g)；取上清液分别稀释2、4、8倍后注入样品孔，浓缩胶电流8ma，分离胶电流15ma进行sds-page检测；电泳完毕后，用0.05％考马斯亮蓝r-250过夜染色，用9％冰乙酸和50％乙醇溶液脱色。

其中，所述上样缓冲液是：950μla液，50μlβ-巯基乙醇。

其中，所述a液是：1.25mltris-hcl(ph6.8，0.5m)，2.5ml甘油，2mlsds(10％)。

优选方式下，步骤s3所述切胶具体为：从步骤s2制得的胶上选中较为清晰地蛋白质条带(虾夷扇贝-1、虾夷扇贝-2、虾夷扇贝-3、虾夷扇贝-4)，用标准标记估算分子量(57.97kda、16.99kda、15.46kda、14.07kda)，用刀片将其切成小块(1mm³)，进行质谱鉴定。

优选方式下，步骤s4所述蛋白质序列筛选具体为：从步骤s3中鉴定出蛋白质序列信息，筛选出相同种属(虾夷扇贝)蛋白质，分子量分别在s2所述虾夷扇贝-1(47.97kda-67.97kda)、虾夷扇贝-2(6.99kda-26.99kda)、虾夷扇贝-3(5.46kda-25.46kda)、虾夷扇贝-4(4.07kda-24.07kda)标准分子量范围之间的蛋白质序列；

优选方式下，步骤s6所述目标肽的筛选具体为：利用expasy中computepi/mw(http://web.expasy.org/compute_pi/)和innovagen的peptidepropertycalculator在线工具(http://www.innovagen.com/proteomics-tools)对步骤s5获得的产物肽进行等电点、净电荷以及溶解性的分析，筛选出溶解性好的阳离子肽。筛选出的肽序列中都含有精氨酸(r)或赖氨酸(k)，根据精氨酸或赖氨酸/ι-卡拉胶作用，进一步筛选出含有赖氨酸(k)的肽。

优选方式下，步骤s7所述合成肽具体为：将步骤s6中筛选出的目标肽序列信息提交至上海强耀生物科技有限公司，委托进行肽的合成，纯度在90～95％以上。

优选方式下，步骤s8所述制备ι-卡拉胶水溶液具体为：卡拉胶加水溶解，溶解温度控制在60～70℃，制成浓度为12～15mg/ml的卡拉胶水溶液。

优选方式下，步骤s9所述制备虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶中，虾夷扇贝二肽的浓度为0.1～0.3mol/l。

优选方式下，步骤s10所述排气泡的方法为：将步骤s9制备的复合凝胶2500～5000rpm离心5～10min除去混合液中的气泡；4～7℃放置8～16h，得到复合凝胶。

实施例1

虾夷扇贝二肽的模拟筛选方法，包括步骤：

s1、原料预处理：取雄性虾夷扇贝生殖腺，2000rpm匀浆10min至无颗粒状，得匀浆液；

s2、sds-page分析：取步骤s1所述匀浆液与上样缓冲液等体积混合，100℃加热5～10min，25℃、200rpm震荡12h，10000g离心10min，取上清液；取所述上清液用上样缓冲液分别稀释2倍、4倍、8倍，所得稀释后的样品10μl进行sds-page检测；所述sds-page检测使用10％分离胶与5％浓缩胶，浓缩胶电流8ma，分离胶电流15ma，电泳完毕后，用0.05％考马斯亮蓝r-250过夜染色，用9％冰乙酸和50％乙醇溶液脱色；其中，所述上样缓冲液是：950μla液，50μlβ-巯基乙醇；所述a液是：1.25mltris-hcl(ph6.8，0.5m)，2.5ml甘油，2mlsds(10％)；电泳结果如图1所示，其中hm、lm分别为highmarker、lowmarker；

s3、蛋白质质谱鉴定：将步骤s2所得sds-page胶上清晰的单一蛋白条带切下，得虾夷扇贝蛋白，其中所述虾夷扇贝蛋白共有四条带，分别命名为虾夷扇贝-1、虾夷扇贝-2、虾夷扇贝-3、虾夷扇贝-4，所述虾夷扇贝-1、虾夷扇贝-2、虾夷扇贝-3、虾夷扇贝-4的分子量分别是：57.97kda、16.99kda、15.46kda、14.07kda，将所述虾夷扇贝-1、虾夷扇贝-2、虾夷扇贝-3、虾夷扇贝-4进行蛋白质质谱鉴定；

s4、蛋白质序列筛选：根据步骤s3所得蛋白质质谱鉴定结果，筛选出属于虾夷扇贝蛋白质、分子量分别在虾夷扇贝-1(47.97kda～67.97kda)、虾夷扇贝-2(6.99kda～26.99kda)、虾夷扇贝-3(5.46kda～25.46kda)、虾夷扇贝-4(4.07kda～24.07kda)标准分子量范围之间的蛋白质序列；筛选结果如表1所示：

表1质谱鉴定结果

s5、insilico分析：将步骤s4筛选后的获得的蛋白质序列，利用biopep在线工具(www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)，选择胰蛋白酶(trypsin)为参数进行模拟酶解，获得产物肽；

s6、目标肽的筛选：利用expasy中computepi/mw(http://web.expasy.org/compute_pi/)和innovagen的peptidepropertycalculator在线工具(http://www.innovagen.com/proteomics-tools)分别对产物肽进行等电点、净电荷以及溶解性的分析，筛选等电点pi>7.0，在ph7.0时带正电荷以及溶解性好的阳离子肽；筛选出的肽序列中都包含精氨酸(r)或赖氨酸(k)。筛选结果如表2所示：

表2虾夷扇贝二肽筛选结果

实施例2

1、使用赖氨酸制备赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶，包括步骤：

s1、制备ι-卡拉胶水溶液：0.0213gι-卡拉胶，加1.7ml去离子水，在65℃下加热15min，制备成12.5mg/ml的ι-卡拉胶水溶液；

s2、制备复合凝胶：向步骤s1制得的ι-卡拉胶水溶液中加入0.0497g实施例1步骤s6筛选出的赖氨酸(k)，混匀，制成虾夷扇贝二肽浓度为0.2mol/l的赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶；

s3、排气泡：将步骤s2制备的复合凝胶5000rpm离心10min除去混合液中的气泡，在4℃放置16h，得到赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶产物(k/ι-c)。

2、使用精氨酸制备精氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶，包括步骤：

s1、制备ι-卡拉胶水溶液：0.0213gι-卡拉胶，加1.7ml去离子水，在65℃下加热15min，制备成12.5mg/ml的ι-卡拉胶水溶液；

s2、制备复合凝胶：向步骤s1制得的ι-卡拉胶水溶液中加入0.0497g实施例1步骤s6筛选出的精氨酸(r)，混匀，制成虾夷扇贝二肽浓度为0.2mol/l的精氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶；

s3、排气泡：将步骤s2制备的复合凝胶5000rpm离心10min除去混合液中的气泡，在4℃放置16h，得到精氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶产物。

经实物图6、7观察，可以发现赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶的凝胶效果要远远高于精氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶，因此，选用带有赖氨酸(k)的二肽进一步判定虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶的凝胶特性。

经流变仪分析，本实施例制备的赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶在频率扫描下，在固定应力0.5％，频率范围为0.1-10hz时，赖氨酸/ι-卡拉胶复合凝胶的储能模量g’(频率扫描模式)为141pa，显示出弹性特征。因此，根据表3中的虾夷扇贝二肽序列，使用化学固相合成法合成9条虾夷扇贝二肽，所述肽的纯度在90％以上。

表3虾夷扇贝二肽筛选结果

实施例3

分别使用实施例2制备的9种虾夷扇贝二肽制备虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶的制备方法，包括步骤：

s1、制备ι-卡拉胶水溶液：0.0213gι-卡拉胶，加1.7ml去离子水，在65℃下加热15min，制备成12.5mg/ml的ι-卡拉胶水溶液；

s2、制备复合凝胶：将虾夷扇贝二肽加入到步骤s1所述ι-卡拉胶水溶液中，制备成虾夷扇贝二肽浓度为0.2mol/l的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶；其中，所述虾夷扇贝二肽为tk、wk、lk、gk、vk、ck、nk、fk或mk中的一种；

s3、排气泡：将步骤s2制备的复合凝胶5000rpm离心10min除去混合液中的气泡，在4℃放置16h，得到虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶产物。

所述虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶产物的凝胶特性如表4所示，mk/ι-卡拉胶复合凝胶的凝胶强度最高。

表4虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶的凝胶特性

经流变仪分析，本实施例制备的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶在频率扫描下，在固定应力0.5％，频率范围为0.1-10hz时，mk/ι-卡拉胶复合凝胶的储能模量g’(频率扫描模式)为4332pa，显示出弹性特征；。

对比例1

s1、制备ι-卡拉胶水溶液：0.0213gι-卡拉胶，加1.7ml去离子水，在65℃下加热15min，制备成12.5mg/ml的ι-卡拉胶水溶液；

s2、排气泡：将步骤s1制备的ι-卡拉胶水溶液6000rpm离心5min除去气泡，在4℃放置12h，得到ι-卡拉胶凝胶产物(ι-c)。

经流变仪分析，本实施例制备的ι-卡拉胶凝胶在频率扫描下，在固定应力0.5％，频率范围为0.1-10hz时，ι-卡拉胶凝胶的储能模量g’(频率扫描模式)为13pa，显示出弹性特征。

对本发明实施例采用sds-page方法获得虾夷扇贝蛋白质序列，结果如图1所示：本发明获得四条条带，并根据nanolc-esi-ms/ms质谱鉴定和筛选获得14种蛋白质序列；形成凝胶的前提是可溶于水中，并且，由于ι-卡拉胶带负电，因此与带正电的虾夷扇贝二肽发生静电相互作用从而产生凝胶性，如图2和3可证明虾夷扇贝二肽是由于溶解性好的阳离子肽与ι-卡拉胶作用形成复合凝胶；图4发现0.2-0.5kda范围内的肽含量较多，该范围内的肽由2-4个氨基酸组成，因此集中研究二肽与ι-卡拉胶的复合凝聚作用。

本发明采用insilico筛选出所有肽序列中都含有精氨酸(r)或赖氨酸(k)，以ι-卡拉胶分别与两者作对照进行凝胶强度的观察，结果如图6、7所示：赖氨酸/ι-卡拉胶相互作用后会产生明显的凝胶性，而精氨酸/ι-卡拉胶则没有显示出凝胶性；对本发明实施例制备的带有赖氨酸的虾夷扇贝二肽/ι-卡拉胶复合凝胶强度进行测定，结果如图6所示：本发明实施例3制备的复合凝胶mk/ι-卡拉胶的凝胶强度显著大于ι-卡拉胶。说明虾夷扇贝二肽mk与ι-卡拉胶具有一定的协同作用，使其凝胶性增强。

经流变仪分析，在频率扫描模式下，在固定应力0.5％，固定频率0.1-10hz时，ι-卡拉胶的流变性能响应值均非常低，储能模量g’值为13pa，赖氨酸/ι-卡拉胶的储能模量g’值为141pa，以上的实验均显示出弹性特征，加入ι-卡拉胶可增强虾夷扇贝二肽的流变特性；本发明实施例3制备的虾夷扇贝二肽mk/ι-卡拉胶复合凝胶的储能模量g’(频率扫描模式)4332pa。本发明制备的虾夷扇贝二肽mk/ι-卡拉胶复合凝胶的流变特性显著高于单独ι-卡拉胶和赖氨酸/ι-卡拉胶复合物。

分别对本发明实施例制备的复合凝胶及单独ι-卡拉胶的流变特性进行测定，测定了频率扫描下的储能模量g’，它是反应物质弹性的指标，同时，mk中包含赖氨酸(k)，因此以赖氨酸/ι-卡拉胶的流变特性作为对照。结果如图5所示，本发明制备的复合凝胶的流变特性显著高于单独ι-卡拉胶和赖氨酸/ι-卡拉胶，说明虾夷扇贝二肽mk与ι-卡拉胶之间存在协同作用，ι-卡拉胶可大幅增强虾夷扇贝二肽的流变特性，即凝胶特性。

目前关于肽/卡拉胶凝胶特性方面的研究较少，卫鹏利用具有一定生理功能的天然食用胶，即卡拉胶、魔芋胶和刺槐豆胶为原料，通过研究复配体系的凝胶性能和流变性能，利用多糖与多肽之间的相互作用，选择出能够稳定大豆多肽的溶胶-凝胶体系；实验中选择了制备果冻常用的κ-卡拉胶，与魔芋胶和剌槐豆胶复配，通过正交实验，以持水性、凝胶强度和粘度作为同等重要的评价指标，确定了三者之间较优的质量配比；应用应力控制流变仪，研究不同浓度下混合胶体溶液的流体类型，并系统地考察了浓度、温度、ph值、蔗糖、氯化钠、柠檬酸钠、大豆多肽和冻融处理对体系粘度的影响；建立了能够检测大豆多肽原料和果冻中大豆多肽含量的化学方法，并在此基础上评价了在果冻制备和贮存过程中果冻内大豆多肽的稳定性。selig等在加热的κ-卡拉胶浆液中用用乳清分离蛋白酶/转谷氨酰胺酶处理乳清分离蛋白，观察到凝胶的强度，变形性和半透明性可能与凝胶形成时存在的肽的大小有关；随着肽大小的减少，所有三个方面都在增加。综上分析，利用本发明的insilico方法制备的复合凝胶与利用卫鹏或selig的方法制备的复合凝胶相比，其方法较为简便，更容易获得肽，在凝胶特性上有较为突出的进步。

综上所述，本发明制备的虾夷扇贝二肽mk/ι-卡拉胶混合凝胶的流变特性显著高于对比样品。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>大连工业大学

<120>一种虾夷扇贝二肽、其虚拟筛选方法及其复合凝胶的制备方法

<130>zr191152lq

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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1