一种TPP核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法与流程

本发明涉及一种tpp核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法。

背景技术：

目前16srrna基因序列广泛应用在细菌分类的研究，但是16srrna基因序列具有相对的稳定性，使得16srrna基因序列进化速率相对较低，无法分辨近缘菌株之间的进化关系，一般只能分析到属的水平，以及16srrna基因序列在物种内存在种内异质性，这也是细菌分类中的一个重要的误差来源。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种tpp核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种tpp核糖开关序列引物，所述引物为3’端带有接头序列的保守序列，所述保守序列为

seqidno:01：nngctgaga，和

seqidno:02：tycctncgc；

本发明还提供了一种肠道菌群分类方法，设计tpp核糖开关序列引物，以klenowfragment酶构建tpp核糖开关基因序列文库，采用特异性扩增制备人类肠道菌的总tpp核糖开关序列，建立一种新的肠道菌群分类标准；所述tpp核糖开关序列引物包含上述保守序列seqidno:01和seqidno:02。

具体包括如下步骤：

一)构建tpp核糖开关基因序列文库，设计带有接头序列的tpp核糖开关保守序列引物，并以人类肠道菌群dna样本为模板，加入klenowfragment酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和超纯水构建混合体系，经孵育程序依次合成tpp核糖开关基因dna序列的第一条链和第二条链，得到总tpp核糖开关dna序列；

其中，孵育程序为：

步骤一)具体步骤如下：

1)tpp核糖开关序列引物设计；所述tpp核糖开关序列引物为带有接头序列的tpp核糖开关保守序列，上游引物和下游引物序列分别为

seqidno:03：ttaaccccacaaacacgggagcnngctgaga，和

seqidno:04：atgcttgattctcctcgctacgtycctncgc；

2)tpp核糖开关基因dna序列第一条链的合成；

①取人类肠道菌群dna样本1000ng，加入10μmseqidno:035μl，补充超纯水使总体系达到20μl，得到20μl混合体系；

②将20μl混合体系在95℃孵育5min；

③将孵育后的20μl混合体系置于冰上，并加入以下组分，得到40μl混合体系：

④将40μl混合体系立即放入pcr中，以孵育程序进行孵育，得到第一条链。

3)tpp核糖开关基因dna序列第二条链的合成；

①在上述孵育后的40μl混合体系置于冰上依次加入如下组分，得到50μl混合体系：

②将50μl混合体系立即放入pcr中，进行如下孵育程序，得到第二条链，得到总tpp核糖开关基因dna样本。

二)将步骤一)产物总tpp核糖开关dna序列进行pcr扩增；其中，步骤二)的上游引物、下游引物序列为

seqidno:05：ttaaccccacaaacacgggagc，和

seqidno:06：atgcttgattctcctcgctacg

取上步总tpp核糖开关基因dna样本中10μl，pcr体系以40μl计组分为下表，

进行pcr反应，循环30轮并于4℃下保存产物。

三)构建总tpp核糖开关dna序列pcr扩增文库；

1)设计总tpp核糖开关dna序列pcr建库引物，其中建库的上游引物、下游引物序列为

seqidno:07：

atgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctttaaccccacaaacacgggagc，和

seqidno:08：

caagcagaagacggcatacgagatgcatatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcatgcttgattctcctcgctacg，

建库的下游引物包括索引序列seqidno:09：gcatat；

2)将步骤二)tpp核糖开关基因的2个样本pcr产物，依次取3μl作为建库模板，组分为下表，

随后进行pcr反应，循环30轮并于4℃下保存产物。

四)illumina二代测序服务。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本方案建立了一种特异性扩增具有短保守dna片段的新方法，并应用该方法特异性扩增出人类肠道菌中总tpp核糖开关序列，可以区分16srrna分不开的物种；

2.核糖开关是调控基因表达的非编码rna，作为细胞核酸组分水平中的分子标准用来区分细菌物种，具有序列较短便于分析的优点，同时核糖开关广泛分布在细菌中，其序列的变异更加丰富，便于和肠道菌功能相结合，能够实现有效区分近缘菌株之间的细小差别。

附图说明

图1为本发明分类方法流程示意图；

图2为16srrna基因v4片段；

图3为tpp核糖开关文库。

具体实施方式

请查阅图1～3，本实施例的一种肠道菌群分类方法，包括如下步骤：

一)tpp核糖开关基因序列文库的构建：

1)tpp核糖开关基因序列引物设计；

所述tpp核糖开关基因序列的保守序列(下划线)5’端接有adapter序列，在本实施例中，adapter序列采用与后续高通量测序机器适配接头序列，具体如下：

2)tpp核糖开关基因dna序列第一条链的合成；

①取肠道菌样品dna1000ng，加入上述tpp核糖开关10μmreverseprimer5μl，补充超纯水使总体系达到20μl，得到20μl混合体系；

②将20μl混合体系在95℃孵育5min；

③将孵育后的20μl混合体系置于冰上，并加入以下组分，得到40μl混合体系：

④将40μl混合体系立即放入pcr中，进行如下孵育程序，得到第一条链：

3)tpp核糖开关基因dna序列第二条链的合成；

①在上述孵育后的40μl混合体系置于冰上依次加入如下组分，得到50μl混合体系：

②将50μl混合体系立即放入pcr中，进行如下孵育程序，得到第二条链，得到总tpp核糖开关基因dna样本：

二)总tpp核糖开关基因dna样本pcr扩增：

1)pcr扩增引物设计；

本实施例采用总tpp核糖开关基因dna样本adapter序列作为引物，

2)取10μl总tpp核糖开关基因dna样本作为pcr模板，依次加入如下组分：

3)将pcr反应管放入普通pcr仪中，pcr反应程序如下设置：

三)总tpp核糖开关dna序列pcr扩增文库制备：

1)总tpp核糖开关dna序列pcr建库引物p5和97的设计(下划波浪线标记为index序列)；

2)将步骤二)得到的tpp核糖开关基因2个样本pcr产物，依次取3μl作为建库模板；

四)测序，具体为illumina二代测序服务。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110>华侨大学

<120>一种tpp核糖开关序列引物和肠道菌群分类新方法

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

nngctgaga9

<210>2

<211>9

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tycctncgc9

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttaaccccacaaacacgggagcnngctgaga31

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atgcttgattctcctcgctacgtycctncgc31

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttaaccccacaaacacgggagc22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atgcttgattctcctcgctacg22

<210>7

<211>79

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

atgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcttta60

accccacaaacacgggagc79

<210>8

<211>85

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

caagcagaagacggcatacgagatgcatatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccg60

atcatgcttgattctcctcgctacg85

<210>9

<211>6

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gcatat6