本发明涉及烯烃化雌二醇类化合物及其制备与应用。
(二)
背景技术：
《2018年全球癌症统计数据》报告显示，中国癌症发病率及死亡率均列全球首位，其中乳腺癌和肺癌分别是我国女性和男性发病死亡率最高的癌症。而乳腺癌疾病的发生与体内雌激素的含量有着密切的关联。已知雌激素可以刺激雌激素依赖性疾病，如子宫内膜癌和乳腺癌的发生。目前，大多数雌激素依赖性疾病的治疗手段除手术、化疗和免疫疗法外，雌激素生物合成的抑制和雌激素作用的阻断也是这些疾病的标准疗法，但该治疗手段段副作用极大且周期长。当前，不少研究者认为乳腺癌、前列腺癌等的治疗需要采用多模式方法，以根除残留的癌细胞并预防疾病的复发。雌激素可激活mapk通路，包括：增加p27蛋白的降解，进而促进乳腺癌细胞过度增生；与雌激素受体结合，激活其中的akt和erk1/2信号转导通路，促进子宫内膜癌和乳腺癌细胞增殖；通过erk1/2信号通路刺激子宫内膜癌细胞的增殖，而雌二醇可通过非转录效应激活mapk信号通路，促进子宫内膜癌的发生与发展。因此，阻断mapk/er通路有可能成为雌激素依赖性癌症的一个新的分子靶标治疗途径。但是要通过研究阻断信号通路来调控疾病的发生与进展历时久远且涉及因素众多，存在较大的风险。
现已开发了几种抗乳腺癌药物，但该疾病的发病率和死亡率如此之高，且这些类固醇性激素与疾病的发生和进展的相关性仍未得到较好的解释。以至于寻找并改良预防和治疗乳腺癌的药物仍然是热门。
烯烃类化合物因为成本低易得到等优势，在有机合成的发展中占有重要的地位。双键基团是烯烃分子中的官能团，具有活泼的化学性质，可以发生亲电加成反应，硼氢化反应、自由基加成反应及聚合反应等。烯烃自身具有生物学意义得益于烯键上的碳可以进攻生物体内的亲核性蛋白，如巯基蛋白等，形成共价结构，使其结合更牢固，进而更好地发挥作用。烯基砜以及环烯基等都具有一定的生物学价值，且被广泛应用于修饰用化合物。但是雌激素类药物由于存在羟基基团而难以被修饰，目前对于雌二醇药物的研究通常是对苯环上的羟基进行酯化等修饰，而对于其邻位的修饰微乎其微，故对雌二醇药物进行邻位修饰，进一步引入具有生物学意义的烯烃化合物对于进一步确定药物作用位点，进而实现新药开发及研究具有重要的生命学意义。因此对雌激素类抗肿瘤药物的修饰已然成为药物专家研究的新的方向。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供具有良好的抗肿瘤活性的烯烃化雌二醇类化合物，以及其制备方法与应用。
本发明采用的技术方案是：
烯烃化雌二醇类化合物，其结构式为下式之一：
本发明还涉及制备所述烯烃化雌二醇类化合物的方法。
所述化合物为式(1)～式(4)化合物之一时，所述方法包括：
(a)将雌二醇溶于乙腈溶剂中，加入n-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸铟，于20～50℃反应完全后，反应液经分离提纯得到式(7)所示的2-碘代雌二醇；
(b)将2-碘代雌二醇溶于n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，加入烯烃化合物、醋酸钯、三乙胺，于80～120℃反应完全后，所得反应液经分离纯化得到式(1)～式(4)化合物之一；所述烯烃化合物为下列之一：甲基乙烯砜、丙烯酸、1-戊烯-3-酮、丙烯酸甲酯。
步骤(a)中雌二醇、n-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸铟物质的量之比为1:0.05～0.2:1.0～1.5。
步骤(b)中三乙胺、醋酸钯、烯烃化合物与2-碘代雌二醇的物质的量之比为2:0.05～0.2:1.0～1.5:1.0～1.5。
所述化合物为式(5)～式(6)化合物之一时，所述方法包括：
(a)将雌二醇溶于无水乙醇中，加入单质碘、30％过氧化氢，于20～50℃反应完全后，所得反应液经分离提纯得到式(8)所示的2,4-双碘代雌二醇；
(b)将2,4-双碘代雌二醇溶于n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，加入烯烃化合物、醋酸钯、三乙胺，于80～120℃反应完全后，所得反应液经分离纯化得到式(5)～式(6)化合物之一；所述烯烃化合物为苯乙烯或丙烯酸甲酯。
步骤(a)中雌二醇、单质碘、过氧化氢物质的量之比为1:0.3～0.6:1～3。
步骤(b)中三乙胺、醋酸钯、烯烃化合物与2,4-双碘代雌二醇的物质的量之比为2:0.05～0.2:1～3:1.0～1.5。
所述烯烃化雌二醇类化合物分离纯化方法可如下：反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、室温下旋转蒸除溶剂，得到粗品，将粗品进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:3～10的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.4～0.6的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到烯烃化雌二醇类化合物。
本发明还涉及所述烯烃化雌二醇类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述抗肿瘤药物为防治前列腺癌或乳腺癌的药物。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明通过不同位点修饰，得到烯烃化雌二醇类化合物具有良好的抗肿瘤活性，尤其是对人前列腺癌细胞系pc-3以及乳腺癌细胞mcf-7具有较优异的抑制活性，抗肿瘤活性可提高2～3倍。
(2)本发明通过筛选提供雌二醇药物最适烯烃化修饰位点(2号位点为最适修饰位点)，为雌二醇药物的修饰奠定了基础。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：制备2-碘代雌二醇中间体
0.1mmol雌二醇加入4ml的乙腈溶剂中，向其中加入0.01mmol三氟甲磺酸铟，0.11mmoln-碘代丁二酰亚胺，23℃下反应6-10h，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得式(7)化合物粗品。将ei化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：5的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥后得式式(7)所示的化合物25mg。
淡黄色固体，产率72％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.52(s,1h),6.73(s,1h),5.31(s,1h),2.24(dd,j＝6.2,4.1hz,2h),2.08(s,1h),1.90(d,j＝2.3hz,1h),1.77-1.72(m,2h),1.60-1.53(m,3h),1.44-1.36(m,6h),0.84(s,3h).
实施例2：制备2,4-双碘代雌二醇中间体
0.1mmol雌二醇加入4ml的无水乙醇溶剂中，向其中加入0.05mmol碘单质，0.2mmol过氧化氢(质量浓度30％)，50℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得式(8)化合物粗品。将式(8)化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：3的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.4～0.6的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(8)所示的化合物纯品39mg。
黄色固体，产率88％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.63(s,1h),5.82(s,1h),2.80(dd,j＝17.7,5.7hz,1h),2.67-2.58(m,1h),2.30-2.23(m,1h),2.21-2.09(m,2h),1.99-1.92(m,2h),1.76-1.67(m,2h),1.52-1.45(m,2h),1.39-1.27(m,4h),1.16(ddd,j＝11.9,10.9,7.3hz,1h),0.77(s,3h).
实施例3：制备雌二醇修饰药exs(即化合物(1))
0.1mmol化合物(7)(实施例1制备)加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，向其中加入0.12mmol甲基乙烯砜，0.01mmol醋酸钯，0.2mmol三乙胺，90℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得exs化合物粗品。将exs化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：8的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.4～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式exs所示的化合物纯品9mg。
淡黄色固体，产率15％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.16(d,j＝8.4hz,3h),6.64(dd,j＝8.4,2.7hz,3h),6.58(d,j＝2.5hz,3h),4.92(s,3h),4.73-4.67(m,3h),2.83(d,j＝5.1hz,5h),2.31-2.19(m,9h),2.08(s,9h),1.92-1.86(m,6h),1.79-1.71(m,3h),1.56(ddd,j＝9.0,6.4,3.6hz,3h),1.44(ddd,j＝12.2,8.1,2.3hz,8h),1.41-1.37(m,4h),1.32-1.26(m,4h),0.84(s,9h).esi+:calculatedforc21h26o4s:[m+h]+376.17,found377.2.
实施例4：制备雌二醇修饰药exc(即化合物(2))
0.1mmolei(实施例1制备)加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，向其中加入0.12mmol丙烯酸，0.01mmol醋酸钯，0.2mmol三乙胺，90℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得exc化合物粗品。将exc化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：6的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.4～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式exc所示的化合物纯品9mg。
淡黄色固体，产率17％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.16(d,j＝8.4hz,7h),6.64(dd,j＝8.4,2.7hz,7h),6.58(d,j＝2.5hz,7h),5.00(s,6h),4.74-4.67(m,8h),2.90-2.77(m,15h),2.33-2.15(m,24h),1.91-1.84(m,16h),1.81-1.70(m,11h),1.60-1.52(m,9h),1.50-1.34(m,38h),1.32-1.24(m,11h),0.84(s,24h).esi+:calculatedforc21h26o4:[m+h]+342.18,found343.21.
实施例5：制备雌二醇修饰药exo(即化合物(3))
0.1mmolei(实施例1制备)加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，向其中加入0.12mmol1-戊烯-3-酮，0.01mmol醋酸钯，0.2mmol三乙胺，90℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得exo化合物粗品。将exo化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：5的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.3～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式exo所示的化合物纯品6mg。
黄色固体，产率23％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.16(d,j＝8.1hz,1h),6.64(d,j＝7.7hz,1h),6.58(s,1h),4.70(t,j＝8.4hz,1h),2.86-2.79(m,2h),2.31-2.18(m,3h),2.07(s,2h),1.89(d,j＝12.0hz,2h),1.79-1.71(m,1h),1.60-1.54(m,1h),1.44(dd,j＝17.4,7.7hz,3h),1.32-1.24(m,2h),0.84(s,3h).esi+:calculatedforc22h28o3:[m+h]+340.20,found340.5.
实施例6：制备雌二醇修饰药exoc(即化合物(4))
1mmolei(实施例1制备)加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，向其中加入1.2mmol丙烯酸甲酯，0.1mmol醋酸钯，2mmol三乙胺，90℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得exoc化合物粗品。将exoc化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：8的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.3～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式exoc所示的化合物纯品7mg。
淡黄色固体，产率30％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.66(d,j＝9.5hz,1h),7.37(s,1h),7.06(s,1h),6.35(d,j＝9.4hz,1h),2.99-2.97(m,1h),2.83(s,1h),2.31-2.26(m,4h),2.23(d,j＝4.2hz,1h),2.08(s,3h),1.96(d,j＝3.4hz,1h),1.91-1.89(m,2h),1.77-1.75(m,1h),1.58-1.56(m,2h),1.47(d,j＝6.6hz,4h),0.86(s,3h).
实施例7：制备雌二醇修饰药e2xp(即化合物(5))
0.1mmoleii(实施例2制备)加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，向其中加入0.25mmol苯乙烯，0.01mmol醋酸钯，0.2mmol三乙胺，90℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得e2xp化合物粗品。将e2xp化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：20的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.3～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式e2xp所示的化合物纯品5mg。
淡黄色固体，产率8％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.59-7.53(m,11h),7.51(d,j＝4.7hz,5h),7.42(s,3h),7.37(t,j＝7.6hz,11h),7.27(t,j＝7.2hz,6h),5.68(s,3h),3.77(t,j＝6.2hz,4h),2.86-2.78(m,6h),2.47-2.42(m,4h),2.28-2.22(m,6h),2.18-2.12(m,6h),2.02-1.96(m,8h),1.76-1.71(m,4h),1.56(dd,j＝12.3,3.7hz,4h),1.41-1.35(m,11h),0.80(s,9h).esi+:calculatedforc34h36o2:[m+h]+476.27,found477.30.
实施例8：制备雌二醇修饰药e2xoc(即化合物(6))
0.1mmoleii(实施例2制备)加入4ml的n,n-二甲基甲酰胺溶剂中，向其中加入0.25mmol丙烯酸甲酯，0.01mmol醋酸钯，0.2mmol三乙胺，90℃下反应，反应结束后，反应液中加入饱和nacl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干溶剂，即得e2xoc化合物粗品。将e2xoc化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：8的溶液为流动相，tlc跟踪收集rf值为0.3～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式e2xoc所示的化合物纯品29mg。
黄色固体，产率19％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.99(d,j＝16.1hz,1h),7.74(d,j＝16.5hz,1h),7.45(s,1h),6.51(d,j＝16.1hz,1h),6.37(d,j＝16.5hz,1h),6.14(s,1h),3.84(s,3h),3.81(s,3h),3.77-3.73(m,1h),2.81(dd,j＝17.4,5.6hz,1h),2.70(ddd,j＝17.9,11.2,6.8hz,1h),2.38-2.31(m,1h),2.22-2.09(m,3h),2.01-1.93(m,2h),1.55-1.46(m,3h),1.38-1.28(m,4h),1.22-1.16(m,1h),0.79(s,3h).13cnmr(126mhz,cdcl3)δ167.98,166.78,150.40,140.25,140.05,139.47,133.21,126.53,124.28,121.36,119.75,81.80,77.29,77.03,76.78,51.98,51.66,49.98,43.89,43.16,37.95,36.60,30.53,28.35,26.95,26.46,23.06,11.03.
实施例9：烯烃化雌二醇药物的抗肿瘤检测
选取肿瘤细胞pc-3(人前列腺癌细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)、sw-480(人结肠癌细胞)以及sh-sy5y(人神经母细胞瘤细胞)，采用mtt法进行抗肿瘤细胞增殖活性检测。细胞以4000-5000个/孔的浓度接种至含有10％胎牛血清的1640培养液的96孔板中，并在板盖上加上注释，于5％co2、37℃培养12小时，待细胞在96孔板上贴壁，在无菌操作台中用移液枪加待测药物(实施例3-12制备的化合物)，使每孔药物浓度分别为0.01μm、0.1μm、1μm、10μm、100μm五个浓度梯度，每个浓度设置有五个平行组，以雌二醇作为对照)，并再次将96孔板置于5％co2、37℃培养24小时。取出96孔板，向每个孔中加入10μl的mtt试剂盒试剂(购自promega公司)，避光在5％co2、37℃条件下孵化4小时，吸除上清后加入150ul无菌dmso溶解甲臜，进一步在37℃培养箱中溶解5-10min，最后利用酶标仪测其吸光度。从而计算细胞抑制率和细胞毒性，用icestimatorsoftware软件处理，计算ic50以及ic5095％可信区间，结果见表1所示。
结果显示：①烯烃化修饰后的雌二醇对不同肿瘤细胞有选择性的抑制提升作用。烯烃化修饰后的雌二醇对人结肠癌细胞(sw480)以及人神经母细胞瘤细胞(sh-sy5y)表现出低毒性，而对前列腺癌细胞及乳腺癌细胞的抑制作用提升了2～3倍。②碘代雌激素药物的抗肿瘤增殖能力并未明显提升，而烯烃化修饰后药物的抗肿瘤活性便有明显提升，表明烯烃化基团具有一定的生物学意义。③对比单位点与双位点烯烃化修饰的雌激素药物的抗肿瘤增殖活性，差距不大，表明单位点烯烃化修饰的抗肿瘤细胞增殖能力的提升已较理想，且其对于结构的改变较小，故确定2号位点为最适修饰位点。
表1：烯烃化雌二醇药物的抗肿瘤活性