TBK1作为E3泛素连接酶的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及tbk1作为e3泛素连接酶的应用。

背景技术：

病毒是由一个核酸分子(dna或rna)与蛋白质构成的非细胞形态，由一个保护性外壳包裹一段dna或者rna，可以利用宿主的细胞系统进行自我复制。病毒可以感染几乎所有具有细胞结构的生命体，可以引发多种疾病。

小核糖核酸(rna)病毒科是由rna病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属。其中口蹄疫属于口疮病毒属，是一种由口蹄疫病毒引起的重要的感染偶蹄动物的疾病，口蹄疫病毒(fmdv)是单股正链rna病毒，基因组全长约8200bp，属于小rna病毒科口蹄疫病毒属。fmdv开放阅读框编码一个聚蛋白，翻译后由病毒编码的蛋白酶水解为四个结构蛋白(vp1-vp4)以及八个非结构蛋白(l，2a，2b，2c，3a，3b，3c以及3d)。

目前疫苗接种是特异性预防口蹄疫(fmd)的有效手段，fmd弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制fmd的过程中发挥着重要作用。但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸加工厂等不安全因素，世界上一些地区fmd的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关。因此，如何更好地抑制病毒蛋白的表达，是预防或控制病毒感染的一种有效途径。

tank结合激酶1(tbk1)是磷酸化irf3/7的主要激酶，也是tlr和rlr介导的ifn-β表达中的关键激酶。本发明意外地发现，tbk1不仅能够作为一种新的e3泛素连接酶，而且能有效降解病毒vp3蛋白，进而显著抑制小核糖核酸病毒科，尤其是fmdv的蛋白组装。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种tbk1作为e3泛素连接酶的应用，所述tbk1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述tbk1的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的另一目的在于提供一种tbk1在制备降解病毒蛋白相关药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种tbk1在制备阻止病毒蛋白组装相关药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种tbk1在制备预防或治疗病毒感染相关药物中的应用。

优选地，所述的病毒为小核糖核酸病毒科病毒。

优选地，所述病毒为fmdv、ev71、emcv、svv的任一种病毒。

优选地，所述病毒为fmdv。

优选地，所述的病毒蛋白为结构蛋白。

优选地，所述结构蛋白为vp3。

优选地，所述tbk1加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂的任一种剂型。

本发明的有益效果是：①本发明发现tbk1具有泛素化功能，不仅在体外发生泛素化，还可以在293t细胞中发生体内泛素化，是一种新的e3泛素连接酶；②tbk1能够降解多种小核糖核酸病毒科病毒的结构蛋白vp3，尤其是口蹄疫病毒(fmdv)、肠道病毒(ev71)、脑心肌炎病毒(emcv)以及塞内卡病毒(svv)，可作为病毒抑制剂应用；③tbk1能够降解多种小核糖核酸病毒科病毒的结构蛋白vp3，而对非结构蛋白3a不具有降解作用，具有特异性。

附图说明

图1tbk1体外泛素化分析

图2tbk1体内泛素化分析

图3tbk1降解vp3蛋白分析

图4tbk1降解vp3蛋白的剂量依赖性分析

图5wb检测tbk1^-/-mefs细胞中tbk1的表达情况

图6fmdv感染tbk1^-/-mefs和tbk1^+/+mefs细胞的分析

图7tbk1对fmdv、ev71、emcv、svv的结构蛋白vp3的影响

图8不同生物体来源的tbk1基因中四个半胱氨酸保守序列比对分析

图9tbk1基因的四个半光氨酸突变体对vp3蛋白降解的影响

图10突变体tbk1c426/605a对vp3蛋白降解的影响

图11突变体tbk1c426/605a对天然免疫的影响

图12突变体tbk1c426/605a的泛素化分析

图13tbk1降解vp3蛋白的特异性分析

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料和试剂来源入下：

fmdv由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫病毒参考实验室提供；

pcdna3.1-flag-tbk1质粒、pcdna3.1-ha-tbk1质粒、pcdna3.1质粒、mef细胞、hek-293t细胞、pcdna3.1-ha-ub质粒、pcdna3.1-ha-visa质粒、pcdna3.1-ha-rig-i质粒、pcdna3.1-ha-irf3-5d质粒、pcdna3.1-ha-irf7质粒、pcdna3.1-ha-tbk1质粒、pcdna3.1-ha-mita质粒、pcdna3.1-ha-rig-i质粒、pcdna3.1-ha-mda5质粒、pcdna3.1-flag-vp3质粒、pgl-u6-grna-tbk1质粒、pst1374-cas9-d10a质粒、pcdna3.1-flag-3a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c423a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c426a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c471a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c605质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c426/605a质粒、pcdna3.1-flag-tbk1c426/605a质粒、pcdna3.1-fmdv-myc-vp3质粒、pcdna3.1-ev71-myc-vp3质粒、pcdna3.1-emcv-myc-vp3质粒、pcdna3.1-svv-myc-vp3质粒均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司。

实施例1tbk1作为e3泛素连接酶的活性研究

1.1tbk1体外泛素化实验

1.1.1质粒的体外转录

(1)根据体外转录试剂盒(tntquickcoupledtranscription/translationsystemskit)说明，将待检测pcdna3.1-flag-tbk1质粒(1μg)和对照质粒pcdna3.1(1μg)分别用与tntquickmastermix(24μl)，methionine(1.2μl)，0.5μg/μlplasmid(2μl)，h2o(2.8μl)混合制备成反应物；

(2)将上述反应物置于30℃条件下反应60-90min，获得体外转录产物pcdna3.1-flag-tbk1蛋白。

1.1.2泛素化分析实验：

(1)根据体外泛素试剂盒(enzolifesciences)说明书，将上述体外转录产物pcdna3.1-flag-tbk1蛋白(7.5μl)与dh2o(14μl)，10×ubiquitionylationbuffer(5μl)，100u/mlipp(10μl)，50mmdtt(1μl)，0.1mmg-atp(2.5μl)，reticulocytecelllysate(7.5μl)，pcdna3.1-flag-tbk1，50mm20×bio-ub(2.5μl)均匀混合制备成反应物；

(2)将上述反应物置于37℃下反应30-60min，用hrp-streptavidin进行westernblot检测。

1.1.3实验结果

实验结果如图1所示，tbk1与bio-ub结合，发生了体外泛素化。

1.2tbk1质粒的体内泛素化实验

1.2.1实验步骤

(1)hek-293t细胞(1×10⁷)铺12孔板，当其密度达到40％-60％时，转染pcdna3.1-flag-tbk1(0μg，5μg，10μg)和pcdna3.1-ha-ub质粒(2μg)；

(2)转染24h后，用100μl含1％sds的细胞裂解液(20mmtris、150mmnacl、10μg/mlleupeptin、1％triton、10μg/mlaprotinin、1mmedta、1mmphenylmethylsulfonylfluoride、ph7.5)振荡；

(3)震荡结束后在95℃下加热10min，并将900μl不含sds的裂解液加入其中，4℃12000rpm离心10min，取上清100μl备用，余下上清加入flag抗体与proteing磁珠。

(4)将样品放在静音混合器4℃上孵育4h。

(5)用细胞裂解液(含0.5mnacl)洗三次proteing磁珠，每次1ml，用以洗去非特异性结合的蛋白。然后加上2×sds聚丙烯酰氨凝胶样品缓冲液60μl，95℃煮5-10min，13000rpm离心1min待检测。

(6)取步骤(3)中备用的100μl上清，加6×sds聚丙烯酰氨凝胶上样缓冲液20μl，95℃煮5min，用以检测外源性蛋白的表达情况。

1.2.2实验结果

实验结果如图2所示，tbk1与ha-ub结合，在hek-293t细胞中发生了泛素化，随着tbk1浓度的增加，检测到的体内泛素化水平逐渐增加，表明tbk1能在体内发生泛素化。

综上实验表明，tbk1具有泛素化功能，是一种新的e3泛素连接酶。

实施例2降解fmdv结构蛋白vp3的信号通路分子分析

2.1实验步骤

(1)hek-293t细胞铺12孔板，待细胞长至60％-80％时，将信号通路分子的质粒(pcdna3.1-ha-visa，pcdna3.1-ha-rig-i，pcdna3.1-ha-irf3-5d，pcdna3.1-ha-irf7，pcdna3.1-ha-tbk1，pcdna3.1-ha-mita，pcdna3.1-ha-rig-i，pcdna3.1-ha-mda5)各1μg，分别与fmdv的vp3质粒1μg共转染到293t细胞中；

(2)转染24h后收样，用冷却的pbs洗1-2遍，加入100μl的sdsloadingbuffer进行裂解，wb方法检测vp3蛋白的表达情况。

2.2实验结果

结果如图3所示，只有在tbk1质粒存在的情况下，vp3蛋白没有表达，因此，上述信号通路分子中只有tbk1能够抑制vp3蛋白的表达，说明tbk1能够降解fmdv的vp3蛋白。

实施例3tbk1降解fmdv结构蛋白vp3的分析

3.1实验步骤

(1)hek-293t细胞铺12孔板，细胞长至60％-80％时，转染pcdna3.1-flag-vp3质粒以及pcdna3.1-ha-tbk1质粒，其中分别以pcdna3.1-flag-vp3质粒1μg(恒量)，pcdna3.1-ha-tbk1质粒为0.5μg、1μg、1.5μg、2μg(变量递增)，或者pcdna3.1-ha-tbk1质粒2μg(恒量)，pcdna3.1-flag-vp3质粒0.5μg、1μg、1.5μg、2μg(变量递增)进行共转染；

(2)转染24h后收样，用冷却的pbs洗1-2遍，加入100μl的sdsloadingbuffer裂解，wb检测pcdna3.1-flag-vp3质粒以及pcdna3.1-ha-tbk1质粒的表达情况。

3.2实验结果

结果如图4所示：不管是在pcdna3.1-flag-vp3质粒含量不变，pcdna3.1-ha-tbk1质粒变量递增的情况下，还是pcdna3.1-ha-tbk1质粒含量不变，pcdna3.1-flag-vp3质粒变量递增的情况下，tbk1都能够降解vp3蛋白，并且tbk1的过度表达以剂量依赖性的方式降解了vp3蛋白。

实施例4敲除tbk1基因对vp3蛋白降解的影响

4.1tbk1^-/-mefs细胞系的构建

4.1.1实验步骤

(1)退火偶联，将浓度为10μm的crispr/cas9f(cggcgagtcaactccggcca)和r(tggccggagttgactcgccg)引导序列(5μl)，与0.5mnacl(6μl)以及水(24μl)混合，将退火后的引物置于95℃水浴锅中5min，然后拿出自然降温至室温；

(2)按照说明书，用fastdigestbsmbi将pgl-u6-grna载体切出粘性末端；将5μl退火后的上述引物与2μl酶切载体用t4连接酶混合，室温连接30min；

(3)取5μl连接产物与50μl感受态dh5α混合，热激30秒，涂板；

(4)挑单克隆，测序，提质粒，得到的重组质粒记为pgl-u6-grna-tbk1；

(5)将mef细胞接种至10cm皿，用8mldmem培养基培养过夜(密度约70-80％)，并用脂质体2000转染pgl-u6-grna-tbk1质粒和pst1374-cas9-d10a质粒(质粒比为1:1)；

(6)转染24h后加入puromycin培养基筛选，筛选时间为7天；

(7)换为正常的dmem培养基，从转染后的mef细胞中获取tbk1基因敲除的mef细胞系(tbk1^-/-mefs)；

(8)通过westernblot检测tbk1^-/-mefs细胞中tbk1的表达情况。

4.1.2实验结果

结果如图5所示，wb检测表明，tbk1^-/-mefs细胞中，tbk1没有表达，说明tbk1^-/-mefs细胞构建成功。

4.2fmdv感染tbk1^-/-mefs细胞

4.2.1实验步骤

(1)tbk1^+/+mefs细胞(没有敲除tbk1的野生型mef细胞)和tbk1^-/-mefs细胞(敲除tbk1的mef细胞)铺于12孔板，12h后接fmdv(moi＝0.1)，分别在12h和16h收集样品，进行绝对定量q-pcr实验，检测fmdv基因的拷贝数。

(2)在步骤(1)的样品中加入trizol试剂(500μl)裂解5min，再加入氯仿(100μl)混匀，室温放置10min后，在4℃，12000rpm离心15min，取上清；

(3)取步骤(2)中的上清200μl到1.5mlep管中，并加入异丙醇(200μl)混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min；

(4)去上清后加入1ml75％乙醇，4℃12000rpm离心5min，去上清干燥并加入depc水溶解。

4.2.2q-pcr反应体系

反应试剂：2×onesteprt-pcrbufferⅲ(12.5ml)，takaraextaqhs(0.5ml)，primerscriprtenzymemixⅱ(0.5μl)，正向引物(5’actgggttttacaaacctgtga-3c，0.5μl)，反向引物(5’gcgagtcctgccacgga-3c，0.5μl)，探针(5fam-tcctttgcacgccgtgggac-tamra--3a，1μl)，rna(2μl)，h2o(7.5μl)；

反应条件：42℃，15min；95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s；2-4共40个循环。

4.2.3实验结果

实验结果如图6所示，不管是在fmdv感染mef细胞后12h还是16h后，tbk1^-/-mefs细胞中fmdv基因拷贝数均显著高于tbk1^+/+mefs细胞，由此说明，敲除tbk1基因后，fmdv感染mef细胞的能力显著增强。

实施例5tbk1对其它小rna病毒科vp3蛋白降解

5.1实验步骤

(1)293t细胞铺于12孔板，12h后分别共转染pcdna3.1载体上带ha标签的tbk1质粒(pcdna3.1-ha-tbk1，0μg，0.25μg，0.5μg)和pcdna3.1载体上带myc标签的fmdv、ev71、emcv以及svv的vp3结构蛋白质粒(pcdna3.1-fmdv-myc-vp3，pcdna3.1-ev71-myc-vp3，pcdna3.1-emcv-myc-vp3和pcdna3.1-svv-myc-vp3，各1μg)；

(2)转染24h后，用sds-loadingbuffer裂解，wb检测tbk1和vp3的表达。

5.2实验结果

结果如图7所示，随着tbk1含量的增加，fmdv、ev71、emcv、svv结构蛋白vp3的表达显著降低或者抑制，说明tbk1对小核糖核酸病毒科(fmdv、ev71、emcv、svv)的结构蛋白vp3均有降解作用。

实施例6tbk1降解vp3蛋白的泛素化位点分析

6.1tbk1中四种保守半胱氨酸的序列分析

将人、小鼠、牛、猴、猪、大鼠六种不同生物体来源的tbk1半胱氨酸保守序列进行比对，分析鉴定了tbk1中的四个保守半胱氨酸c423、c426、c471和c605，其序列如图8所示。

6.2tbk1降解vp3蛋白的位点分析

(1)将上述四种半胱氨酸c423、c426、c471和c605分别突变为丙氨酸，构建tbk1突变体(tbk1c423a、tbk1c426a、tbk1c471a、tbk1c605，由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建)，并获得pcdna3.1-ha-tbk1c423a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c426a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c471a质粒、pcdna3.1-ha-tbk1c605质粒，通过转染实验，检测tbk1四种突变体对fmdv结构蛋白vp3的影响。

结果如图9所示，将c423、和c471位点处的半胱氨酸突变为丙氨酸时产生的tbk1突变体(tbk1c423a和tbk1c471a)仍然能够降解fmdv的vp3结构蛋白，说明c423、和c471并不是降解fmdv的vp3结构蛋白的位点；而将c426和c605突变为丙氨酸时产生tbk1突变体(tbk1c426a和tbk1c605)后，不会降解fmdv结构蛋白vp3，说明c426和c605是降解fmdv结构蛋白vp3的位点。

(2)将c426和c605半胱氨酸同时突变为丙氨酸，得到突变体tbk1c426/605a，并构建pcdna3.1-ha-tbk1c426/605a质粒，检测tbk1c426/605a突变体对fmdv结构蛋白vp3降解的影响。

实验结果如图10显示，将c426和c605位点处的半胱氨酸同时突变为丙氨酸，得到突变体tbk1c426/605a对fmdv结构蛋白vp3的表达没有影响。

上述实验表明c426和c605位点处的半胱氨酸分别或同时突变为丙氨酸后，都不会再降解fmdv的结构蛋白vp3，再次证明了c426和c605是tbk1降解fmdv的结构蛋白vp3的关键位点。

6.3tbk1c426/605a突变体对其天然免疫活性的影响

将tbk1的c426和c605半胱氨酸同时突变为丙氨酸，以评估其在tbk1激活中的作用。

结果如图11所示，突变体tbk1c426/605a对tbk1介导的irf3磷酸化和tbk1的自磷酸化没有影响。说明，tbk1通过c426和c605位点降解vp3蛋过程与其天然免疫活性无关。

6.4tbk1c426/605a突变体体外泛素化分析

(1)根据实施例1中质粒的体外转录操作过程，将pcdna3.1-flag-tbk1、pcdna3.1-flag-tbk1c426/605a、以及空载pcdna3.1质粒各1μg，进行体外转录。

(2)根据实施例1中的体外泛素化分析步骤，对步骤(1)中体外转录的产物进行体外泛素化分析。

(3)实验结果如图12所示，将tbk1的c426和c605位点的半胱氨酸同时突变为丙氨酸得到的突变体tbk1c426/605a的体外泛素化现象消失。说明，tbk1的c426和c605位点是通过泛素化作用来降解fmdv结构蛋白vp3的关键位点。

实施例7tbk1降解fmdv的vp3蛋白的特异性分析

7.1实验步骤

(1)293t细胞铺12孔板，细胞长至60％-80％时，tbk1质粒(0.25μg)分别共转染pcdna3.1-flag-vp3质粒(1μg)和pcdna3.1-flag-3a质粒(1μg)；

(2)转染24h后收样，用冷却的pbs洗1-2遍，加入sdsloadingbuffer(100μl)裂解；

(3)wb检测tbk1质粒，vp3蛋白以及3a质粒的表达情况。

7.2实验结果

结果如图13所示，tbk1质粒能够降解fmdv的结构蛋白vp3，但对非结构蛋白3a无影响。说明tbk1质粒能够特异性降解fmdv的结构蛋白vp3。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>tbk1作为e3泛素连接酶的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2190

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>1

atgcagagcacttctaatcatctgtggcttttatctgatattttaggccaaggagctact60

gcaaatgtctttcgtggaagacataagaaaactggtgatttatttgctatcaaagtattt120

aataacataagcttccttcgtccagtggatgttcaaatgagagaatttgaagtgttgaaa180

aaactcaatcacaaaaatattgtcaaattatttgctattgaagaggagacaacaacaaga240

cataaagtacttattatggaattttgtccatgtgggagtttatacactgttttagaagaa300

ccttctaatgcctatggactaccagaatctgaattcttaattgttttgcgagatgtggtg360

ggtggaatgaatcatctacgagagaatggtatagtgcaccgtgatatcaagccaggaaat420

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cttgcaaacatccttgaagcagatcaggaaaagtgttggggttttgaccagttttttgca900

gaaactagtgatatacttcaccgaatggtaattcatgttttttcgctacaacaaatgaca960

gctcataagatttatattcatagctataatactgctactatatttcatgaactggtatat1020

aaacaaaccaaaattatttcttcaaatcaagaacttatctacgaagggcgacgcttagtc1080

ttagaacctggaaggctggcacaacatttccctaaaactactgaggaaaaccctatattt1140

gtagtaagccgggaacctctgaataccataggattaatatatgaaaaaatttccctccct1200

aaagtacatccacgttatgatttagacggggatgctagcatggctaaggcaataacaggg1260

gttgtgtgttatgcctgcagaattgccagtaccttactgctttatcaggaattaatgcga1320

aaggggatacgatggctgattgaattaattaaagatgattacaatgaaactgttcacaaa1380

aagacagaagttgtgatcacattggatttctgtatcagaaacattgaaaaaactgtgaaa1440

gtatatgaaaagttgatgaagatcaacctggaagcggcagagttaggtgaaatttcagac1500

atacacaccaaattgttgagactttccagttctcagggaacaatagaaaccagtcttcag1560

gatatcgacagcagattatctccaggtggatcactggcagacgcatgggcacatcaagaa1620

ggcactcatccgaaagacagaaatgtagaaaaactacaagtcctgttaaattgcatgaca1680

gagatttactatcagttcaaaaaagacaaagcagaacgtagattagcttataatgaagaa1740

caaatccacaaatttgataagcaaaaactgtattaccatgccacaaaagctatgacgcac1800

tttacagatgaatgtgttaaaaagtatgaggcatttttgaataagtcagaagaatggata1860

agaaagatgcttcatcttaggaaacagttattatcgctgactaatcagtgttttgatatt1920

gaagaagaagtatcaaaatatcaagaatatactaatgagttacaagaaactctgcctcag1980

aaaatgtttacagcttccagtggaatcaaacataccatgaccccaatttatccaagttct2040

aacacattagtagaaatgactcttggtatgaagaaattaaaggaagagatggaaggggtg2100

gttaaagaacttgctgaaaataaccacattttagaaaggtttggctctttaaccatggat2160

ggtggccttcgcaacgttgactgtctttag2190

<210>2

<211>729

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>2

metglnserthrserasnhisleutrpleuleuseraspileleugly

151015

glnglyalathralaasnvalpheargglyarghislyslysthrgly

202530

aspleuphealailelysvalpheasnasnileserpheleuargpro

354045

valaspvalglnmetarggluphegluvalleulyslysleuasnhis

505560

lysasnilevallysleuphealailegluglugluthrthrthrarg

65707580

hislysvalleuilemetgluphecysprocysglyserleutyrthr

859095

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115120125

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130135140

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195200205

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210215220

gluglyproargargasnlysgluvalmettyrlysileilethrgly

225230235240

lysproserglyalaileserglyvalglnlysalagluasnglypro

245250255

ileasptrpserglyaspmetprovalsercysserleuserarggly

260265270

leuglnvalleuleuthrprovalleualaasnileleuglualaasp

275280285

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